Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:14 min. • July 8th, 2025
Tome un cultivo de Staphylococcus aureus, una bacteria patógena que secreta leucocidina, una toxina formadora de poros, que comprende componentes monoméricos S y F.
Granular las células y diluir en serie el sobrenadante. Transfiera el sobrenadante que contiene leucocidina a una microplaca que tenga leucocitos polimorfonucleares, o PMN, e incube.
El componente S se une a receptores transmembrana específicos en PMN, seguido de heterooligomerización con el componente F para insertarlo en la membrana celular, lo que resulta en la formación de poros.
El poro provoca una disminución de los iones de potasio intracelulares, activando la proteína 3 o NLRP3 que contiene el dominio de pirina de la familia NLR.
NLRP3 se une a una proteína similar a una mancha asociada a la apoptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasa, o ASC, que recluta pro-caspasa-1, formando un inflamasoma.
La autoproteólisis convierte la pro-caspasa-1 en caspasa-1 activa, desencadenando la muerte celular.
Cosecha las celdas a intervalos definidos. Agregue yoduro de propidio o PI, que ingresa a las células muertas a través de membranas dañadas para unirse al ADN, emitiendo fluorescencia.
Usando citometría de flujo, cuantifique las células teñidas con PI para evaluar el efecto citotóxico tanto de la concentración de leucocidina como del tiempo de incubación.
Cultive S. aureus durante la noche en medios apropiados, utilizando una incubadora agitadora a 37 grados Celsius el día anterior al experimento. Subcultivar S. aureus realizando una dilución de 1 a 100 de cultivos de bacterias durante la noche con medios frescos. Incube a 37 grados centígrados agitando hasta que las bacterias alcancen la fase de crecimiento estacionario temprano. Después de cinco horas de crecimiento, transfiera 1 mililitro de subcultivo de S. aureus a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifugue a 5000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Después de la centrifugación, aspire los sobrenadantes. Pase los sobrenadantes aspirados a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y colóquelos en hielo. Realice diluciones en serie de sobrenadante con medios helados utilizados para cultivar Staph aureus. Agregue suavemente muestras de sobrenadante o medios solos para controles negativos y positivos a pocillos individuales de placas de 96 pocillos que contengan PMN y hielo como se describió anteriormente.
Frote suavemente la placa para distribuir sobrenadantes y pocillos, e incube a 37 grados centígrados. En los momentos deseados, retire el plato de la incubadora y colóquelo en hielo. Agregue 300 microlitros de DPBS helado que contengan 1 microlitro de yoduro de propidio a cada tubo de citometría de flujo. Transfiera las muestras a tubos de citometría de flujo sobre hielo. Para el pocillo de control positivo, agregue 20 microlitros de Triton X al 10% a la muestra antes de transferirla a un tubo de citometría de flujo. Analice la tinción de yoduro de propidio de PMN intoxicados mediante citometría de flujo.