JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 3:35 min • July 8th, 2025
Tome cepas de Staphylococcus aureus virulentas y menos virulentas.
Agregue suero para opsonizar las bacterias.
Transfiera las concentraciones bacterianas crecientes a pocillos de placas de pocillos múltiples refrigerados que contengan neutrófilos. Las bajas temperaturas evitan la activación de neutrófilos.
Centrífuga para facilitar la fagocitosis sincronizada.
Los receptores de neutrófilos se unen a las opsoninas, desencadenando la internalización bacteriana en fagosomas.
En las bacterias virulentas, el ambiente fagosomal desencadena la expresión de toxinas citolíticas.
Estas toxinas forman poros, alterando los fagosomas y comprometiendo la integridad de la membrana de neutrófilos.
Sin embargo, las bacterias menos virulentas exhiben una expresión reducida de toxina citolítica.
Después de la incubación, separe los neutrófilos y transfiéralos a tubos de citómetro de flujo que contengan colorante fluorescente de yoduro de propidio (PI).
El tinte ingresa a los neutrófilos con membranas comprometidas y tiñe el ADN.
Usando un citómetro de flujo, analice los neutrófilos para la tinción de PI.
Un aumento dependiente de la concentración en la proporción de neutrófilos positivos para PI después de la fagocitosis de la cepa virulenta, en comparación con la cepa menos virulenta, indica la citotoxicidad de la cepa virulenta contra los neutrófilos.
Cuando el Staph aureus subcultivado haya alcanzado un crecimiento exponencial medio, transfiera 1 mililitro de bacterias cultivadas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y centrifugue a 5000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Lave S. aureus aspirando sobrenadante sin alterar el sedimento y vuelva a suspender las bacterias granuladas en DPBS de 1 mililitro. Agite las muestras durante 30 segundos. Centrifugar las muestras a 5000 g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
Para opsonizar Staph aureus, primero, vuelva a suspender el gránulo bacteriano en 1 mililitro de suero humano al 20%. Luego, incube las muestras a 37 grados centígrados con agitación durante 15 minutos. Lavar el Staph aureus opsonizado después de la centrifugación, como se ha mostrado anteriormente. Diluya las cepas opsonizadas de Staph aureus a 1 x 108 unidades formadoras de colonias, UFC por mililitro, con RPMI heladas. Agite la muestra durante 30 segundos y colóquela en hielo.
Confirme las concentraciones de Staph aureus utilizadas para estos ensayos sembrando de 1 a 10 diluciones seriadas de bacterias en agar. Suavemente, agregue 100 microlitros por pocillo de cada cepa de Staph aureus, o RPMI, para controles positivos y negativos a PMN en una placa de 96 pocillos en hielo del paso 1.14. Placa de roca suave para distribuir Staph aureus en los pozos.
Sincronice la fagocitosis centrifugando la placa a 500 g durante ocho minutos a 4 grados Celsius e incube la placa a 37 grados Celsius, inmediatamente después de la centrifugación como tiempo 0. En los puntos de tiempo deseados, coloque la placa en hielo y agregue 200 microlitros de DPBS helado que contenga 1 microlitro de yoduro de propidio a cada tubo de citometría de flujo, luego, transfiera las muestras a su tubo correspondiente.