Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 5:26 min. • July 8th, 2025
Exponga a un ratón a gotas de aerosol que contengan Mycobacterium tuberculosis.
Las bacterias llegan a la luz de los alvéolos, los pequeños sacos de aire dentro de los pulmones, que contienen macrófagos.
Los receptores de reconocimiento de patrones de macrófagos se unen a los patrones moleculares asociados a patógenos en las bacterias, lo que desencadena su engullimiento en un fagosoma.
Las bacterias engullidas secretan proteínas especializadas, que rompen la membrana del fagosoma. Las bacterias escapan al citoplasma y se reproducen.
Después de la infección, anestesiar al ratón. Administrar por vía intraperitoneal un sustrato indicador de la enzima bacteriana β-lactamasa para la fluorescencia de la enzima indicadora o la obtención de imágenes REF.
El sustrato llega a los alvéolos pulmonares a través de la circulación y entra en las células infectadas.
Penetra en la membrana externa bacteriana para llegar al espacio periplásmico que contiene β-lactamasa.
El sustrato contiene un anillo de β lactámicos que conecta un fluorocromo y un extintor. Debido a la proximidad, la fluorescencia del fluorocromo es absorbida por el extintor.
La β-lactamasa hidroliza el anillo β-lactámico, liberando el fluoróforo y dando como resultado la emisión de fluorescencia.
Imagen de la fluorescencia para evaluar la infección por micobacterias.
Para continuar, cargue animales de peso conocido en la cámara de inoculación encendida. La cámara puede acomodar hasta 90 ratones. Luego, cierre todos los pestillos de la puerta. A continuación, conecte el nebulizador con una abrazadera de acero. Luego, presione el botón de inicio en la cámara y configure el caudal de aire entre 3 y 5 litros por minuto.
El aire comprimido fluirá a aproximadamente 22 a 26 libras por pulgada cuadrada y, lo que es más importante, debería ser posible ver la niebla de inóculo en la cámara. Después de 15 minutos, aparecerá una luz roja en la parte frontal del panel de control y una señal audible indicará el final de la carrera. Luego, presione el botón de reinicio para restablecer los temporizadores. Para liberar el vacío, presione el pequeño botón rojo en la puerta de la cámara.
Luego, abra la puerta de la cámara y devuelva a los ratones a sus jaulas de origen. En el futuro, mantenga a los animales en la sala de contención. A continuación, devuelva el frasco en el recipiente de transporte al gabinete de bioseguridad. Allí, deseche la suspensión bacteriana restante en un contenedor de desechos designado. Luego, coloque el frasco del nebulizador usado dentro de una bolsa de riesgo biológico y selle la bolsa para transportarla al autoclave.
Para limpiar la cámara, rocíe las superficies interiores con fenol tamponado y etanol al 70%. Deje que estas soluciones reaccionen sobre esas superficies durante 10 minutos, luego límpielas bien. Deseche todas las toallitas en la basura de riesgo biológico. Luego, esteriliza en autoclave la basura, el contenedor de desechos y los frascos nebulizadores usados.
Transfiera los animales a la sala de imágenes. Allí, anestesiar a un animal de acuerdo con el protocolo de texto e inyectarle sustrato de contraste mediante inyección intraperitoneal. En el software del sistema de imágenes, inicialice el sistema y continúe cuando la barra de temperatura se vuelva verde. Después de inicializar el sistema, coloque el mouse en la cámara de imágenes.
Asegúrese de que sus fosas nasales estén dentro del cono de la nariz para que reciba anestesia durante las imágenes. Ahora, regrese a la computadora. En el panel de control de adquisición, seleccione fluorescencia, transiluminación, para visualización de todo el animal, o epiiluminación para ver los tejidos pulmonares. Para un solo mouse, establezca el campo de visión en B y el nivel de la lámpara en alto.
Para la exposición, use el tiempo automático, el binning medio y dos o tres para el F/Stop. Luego, configure el filtro de excitación en 745 nanómetros y los filtros de emisión de 780 a 840 nanómetros. A continuación, vaya a la configuración de la secuencia y seleccione de 9 a 12 puntos de transiluminación en el área de interés. Ahora, presione el botón adquirir para recopilar imágenes.