Evaluación de la virulencia de Leishmania en macrófagos cultivados

Comience con una placa de pocillos múltiples que contenga macrófagos derivados de la médula ósea en cubreobjetos.

Trate los macrófagos con promastigotes de Leishmania, la etapa infecciosa del parásito.

Durante la incubación, los parásitos interactúan con los macrófagos, facilitando el ensamblaje de F-actina alrededor del sitio de interacción.

Los macrófagos envuelven a los parásitos en fagosomas rodeados de F-actina, formando vacuolas parasitóforas o PV, un nicho replicativo.

Dentro de los PV, los parásitos liberan factores de supervivencia, aumentando la acumulación de F-actina alrededor de las vacuolas e inhibiendo su fusión con los lisosomas.

Además, los parásitos regulan al alza la producción de hepcidina, una hormona peptídica de macrófagos, que inhibe la liberación de hierro y eleva los niveles de hierro intracelular.

La entrada de hierro en las vacuolas promueve la diferenciación de promastigotes en amastigotes patógenos y facilita su multiplicación, mejorando la virulencia.

Después de la incubación, lavar para eliminar los parásitos libres, luego, fijar y permeabilizar los macrófagos infectados.

Introducir un colorante fluorescente de ácido nucleico para teñir los núcleos de macrófagos y amastigotes infectados.

Bajo un microscopio de fluorescencia, pequeños núcleos agrupados alrededor del gran núcleo del macrófago confirman la presencia de parásitos intracelulares, lo que demuestra la virulencia de Leishmania.

El día siete u ocho después del cultivo, use una punta de aspiración instalada en una línea de vacío para transferir cuatro cubreobjetos de vidrio de 12 milímetros esterilizados en autoclave al fondo de cada pocillo de una placa de cultivo de seis pocillos sin superponerse. Prepare placas idénticas para cada punto de tiempo del experimento. A continuación, lave los cultivos de macrófagos derivados de la médula ósea 2 veces con PBS fresco a 37 grados Celsius y cinco mililitros de PBS sin calcio ni magnesio, suplementados con un EDTA milimolar en cada placa.

Después de cinco minutos a 37 grados Celsius, reúna las células desprendidas en un tubo cónico de 50 mililitros, enjuagando cada placa dos veces con cinco mililitros adicionales de PBS sin calcio ni magnesio. Después de la centrifugación, vuelva a suspender los macrófagos en cinco a 10 ml de medio macrófago fresco derivado de la médula ósea en hielo. Después de contar, diluya las células a una concentración de 5 x 10⁵ por mililitro en un medio de macrófagos frescos derivados de la médula ósea y agregue dos mililitros de células por pocillo a la placa de 6 pocillos. Luego, incube las células durante la noche en la incubadora de cultivo celular.

Para infectar las células con L amazonensis, diluya la suspensión del parásito a la multiplicidad experimental apropiada de infección y agregue de 50 a 100 microlitros de parásitos a cada pocillo de todas las placas de seis pocillos, incluidos todos los puntos de tiempo del experimento. Incubar los macrófagos derivados de la médula ósea durante el período de infección y la temperatura adecuados.

Luego, lave los pocillos tres veces con dos mililitros de PBS fresco a 37 grados Celsius sin calcio ni magnesio por pocillo, y fije las muestras de punto de tiempo inicial con 1,5 a 2 ml de paraformaldehído al 2% durante 10 minutos. Para las placas correspondientes a los puntos de tiempo posteriores, agregue 2 mililitros de medio macrófago fresco derivado de médula ósea a cada pocillo y devuelva las placas a la incubadora adecuada. Luego, fije y lave las celdas para cada punto de tiempo restante como se acaba de demostrar, y almacene las muestras a 4 grados centígrados en PBS fresco.

Para teñir las células con DAPI, reemplace el sobrenadante con 1,5 ml de PBS fresco sin calcio ni magnesio, complementado con detergente no iónico al 0,1% durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de tres lavados de 2 mililitros con PBS sin calcio ni magnesio. A continuación, tiña las células con dos microgramos por mililitro de DAPI en 1 mililitro de PBS durante una hora a temperatura ambiente. Después de tres lavados, coloque los cubreobjetos con la celda hacia abajo en portaobjetos de microscopio de vidrio individuales montados con un reactivo de montaje antidecoloración disponible en el mercado.

Luego, para cuantificar el número de células infectadas, use el objetivo de aceite de inmersión 100x de un microscopio de fluorescencia y el contador Emanuel para identificar el número de núcleos de amastigote más pequeños agrupados alrededor de cada núcleo de macrófago grande teñido con DAPI.