Establecimiento de un modelo de infección mediante microinyección de organoides gástricos con bacterias patógenas

Bajo un microscopio estereoscópico, observe organoides gástricos, estructuras celulares tridimensionales compuestas por células gástricas diferenciadas y células madre.

Introducir un microinyector cargado con Helicobacter pylori, un patógeno gástrico.

Inserte la aguja en el organoide objetivo e inyecte la suspensión bacteriana.

Observe cómo se desarrolla una solución turbia dentro del lumen.

H. pylori emplea una proteína adhesina específica en su superficie para unirse al receptor de la célula gástrica, estableciendo una interacción estable entre las bacterias y las células huésped.

Esta interacción desencadena el alargamiento del pilus de secreción bacteriana, una gran estructura en forma de túnel que se extiende hacia la membrana de la célula huésped.

H. pylori utiliza el pilus de secreción para inyectar factores de virulencia, incluido el gen asociado citotóxico A o en la célula huésped.

Una vez dentro de la célula, sufre fosforilación por la quinasa de la célula huésped.

El fosforilado desregula múltiples cascadas de señalización intracelular que alteran las funciones de la célula huésped, promoviendo la transformación cancerosa.

Recolecte los organoides infectados para su posterior análisis.

Para comenzar la microinyección de organoides, coseche la bacteria H. pylori y lávelos en medio basal de acuerdo con los protocolos estándar. Después de las mediciones de densidad óptica para determinar el número de bacterias, diluya el cultivo a 1 x 10⁹ bacterias por mililitro en medio basal.

Tire del capilar de vidrio en dos agujas de inyección con un extractor de micropipetas y guárdelo en una placa de Petri limpia. Luego, con fórceps, rompa la punta de una aguja de inyección para producir una abertura de aproximadamente 10 micrómetros de ancho.

Trabajando en un microscopio estereoscópico, colóquelo dentro de una campana de cultivo estéril, inserte la aguja en el portainyecciones y fíjela al micromanipulador. Tome aproximadamente 10 microlitros de la solución bacteriana en la aguja. Luego, coloque la placa de cultivo celular de 4 pocillos que contiene organoides gástricos bajo el microscopio estereoscópico.

Navegando con el micromanipulador, coloque la aguja cerca de un organoide. Inserte la aguja en el organoide con un movimiento rápido y luego, inyecte aproximadamente 0,2 microlitros de solución bacteriana en el centro del organoide. Con experiencia, aproximadamente 30 de los organoides más grandes en un pozo se pueden inyectar en 5 minutos. Incube los organoides inyectados durante el tiempo deseado en una incubadora de cultivo celular.

A menudo, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades porque les resulta difícil apuntar de manera eficiente a los organoides. Los organoides gástricos de ratón se vuelven quísticos y son los más fáciles de atacar. Por lo tanto, la inyección de organoides gástricos de ratón con, por ejemplo, un tinte, puede ser una buena práctica para esta técnica.