Evaluación del crecimiento intracelular de mutantes de Coxiella dentro de células eucariotas

Tome una placa de pocillos múltiples que contenga células epiteliales adheridas y trátela con mutantes de Coxiella marcados con proteínas fluorescentes verdes; algunos con mutaciones en el gen del sistema de secreción tipo IV, o gen T4SS, crucial para la replicación.

Los mutantes replicativos interactúan con las células epiteliales, desencadenando el engullimiento de Coxiella, formando vacuola que contiene Coxiella, o CCV, y reclutando glicoproteína de membrana-1 asociada a lisosomas, o LAMP1 a CCV.

Esto facilita la secreción de proteínas efectoras en el citoplasma celular a través del sistema de secreción tipo IV, promoviendo la replicación bacteriana.

Los mutantes con mutaciones en el gen T4SS permanecen sin replicar.

Después de la incubación, tiña las células con un tinte fluorescente, fíjalas y permeabiliza la membrana celular.

Introducir anticuerpos primarios específicos de LAMP1 que interactúan con las proteínas LAMP1 en CCV.

Se superpone con anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo rojo, interactuando con anticuerpos primarios, mientras que el colorante Hoechst tiñe los núcleos de las células.

Bajo un microscopio de epifluorescencia, las vacuolas de fluorescencia roja