Ensayo de infección bacteriana para el estudio de las interacciones anaeróbicas entre bacterias y células huésped

Comience con un cultivo de células endoteliales.

Reemplace el medio con medios anaeróbicos. Incubar en una cámara anaeróbica para equilibrar la temperatura.

Agregue Porphyromonas gingivalis, una bacteria anaeróbica patógena, e incube brevemente.

Las bacterias poseen proyecciones proteicas, conocidas como fimbrias, que se unen a moléculas de adhesión específicas en las células endoteliales, facilitando la adherencia bacteriana.

Esta unión desencadena cascadas de señalización intracelular, lo que resulta en un reordenamiento del citoesqueleto de actina y la internalización bacteriana en fagosomas.

Después de la incubación, retire el medio. Lavar con un tampón anaeróbico para eliminar las bacterias extracelulares no adheridas.

Agregue un detergente suave para permeabilizar las membranas de la célula huésped e inducir la lisis celular, liberando bacterias internalizadas y adheridas a la superficie sin causar daño.

Diluya las bacterias que contienen lisado con medios y prepare diluciones en serie.

Coloque estas diluciones en placas de agar sangre. Incubar en condiciones anaeróbicas para permitir que Porphyromonas gingivalis prolifere y forme colonias.

Después de la incubación, cuente las unidades formadoras de colonias (UFC) en cada placa para cuantificar las bacterias adheridas a la superficie e internalizadas, lo que indica las interacciones bacteria-célula huésped.

Para el cultivo y la experimentación con Porphyromonas gingivalis, se mantiene una cámara anaeróbica de vinilo con una atmósfera artificial que contiene 80% de nitrógeno, 10% de hidrógeno y 10% de dióxido de carbono.

Coloque 30 placas de agar sanguíneo, 500 mililitros de PBS y mililitros de factor de crecimiento endotelial vascular, o medio VEGF, dentro de la cámara anaeróbica con 24 horas de anticipación para equilibrar los reactivos.

Siembre 4 veces 10 a las 5 células endoteliales de la vena umbilical humana, o HUVEC, por pocillo en placas de seis pocillos en medio VEGF y déjelas en la incubadora de cultivo celular durante la noche para su fijación. Prepare cultivos de Porphyromonas gingivalis en infusión cerebro-corazón, o medio BHI, como se describe en el texto adjunto, y permita que los cultivos alcancen la fase logarítmica mientras la densidad óptica del cultivo a 660 nanómetros oscila entre 0,5 y 0,7.

Transfiera las bacterias a un tubo de 15 mililitros y envuelva un trozo de parafilm alrededor de la tapa para evitar la exposición aeróbica. Luego, centrifuga las bacterias a 5.000 veces g durante 10 minutos. Dentro de la cámara anaeróbica, lave las bacterias granuladas con PBS anaeróbico y vuelva a centrifugar a 5,000 veces g durante 10 minutos. Vuelva a suspender las bacterias en medio VEGF.

Para infectar los HUVEC con Porphyromonas gingivalis, transfiera las placas de seis pocillos de la incubadora a la cámara anaeróbica. Aspire el medio de los pocillos de prueba y lave tres veces con PBS anaeróbico.

Determine el número de células de un pocillo representativo mediante un ensayo de exclusión de azul de tripano. Luego, agregue 2 mililitros por pocillo de medio VEGF anaeróbico y coloque las placas a 37 grados centígrados en la incubadora anaeróbica durante 20 minutos para equilibrar.

Determine la densidad óptica de las bacterias y vuelva a suspenderlas en un volumen adecuado de medio VEGF para infectar las células en una multiplicidad de infección de 100 a 1 proporción bacteria-células. Agregue la suspensión bacteriana a las células e incube durante 30 minutos a 37 grados centígrados para la infección. Para la lisis celular, dentro de la cámara anaeróbica, prepare una solución de saponina al 1% en peso por volumen en medio BHI y filtre a través de un filtro de 0,2 micras.

Para estudiar las interacciones bacterianas con las células huésped, retire la placa de seis pocillos de la incubadora y aspire el medio de infección. Lavar tres veces con PBS anaeróbico. Luego, agregue 2 mililitros de solución de saponina a cada pocillo e incube durante 15 minutos para permitir la lisis celular.

A continuación, raspe las células del fondo del pocillo y diluya el lisado celular 1 a 1 con medio BHI. Luego, haga diluciones en serie comenzando en 1 a 100. Placa 200 microlitros de una dilución adecuada en placas de agar sangre. Envuelva las placas con parafilm e incube en una incubadora anaeróbica a 37 grados centígrados durante siete días para permitir la formación de colonias. Luego, usando una caja de luz, cuente las unidades formadoras de colonias o UFC en cada placa.