Visualización de bacterias anaeróbicas internalizadas dentro de las células endoteliales del huésped

Comience con una suspensión de Porphyromonas gingivalis, bacterias patógenas anaeróbicas en crecimiento activo.

Agregue BCECF-AM, un tinte no fluorescente y permeable a las células.

Las esterasas citoplasmáticas activas hidrolizan el tinte en una forma fluorescente e impermeable a las células, tiñendo las bacterias.

centrífuga. Vuelva a suspender las bacterias en medios anaeróbicos.

Agregue las bacterias marcadas a pocillos de placas de pocillos múltiples que contengan cubreobjetos con células endoteliales humanas adheridas.

Incubar en una cámara anaeróbica.

Las fimbrias bacterianas se unen a los receptores de la superficie celular endotelial, iniciando cascadas de señalización intracelular.

Esto conduce a un reordenamiento de actina y a la internalización bacteriana dentro de los fagosomas.

Después de la incubación, lave los cubreobjetos con tampón para eliminar las bacterias no internalizadas.

Fije las células con paraformaldehído para preservar las estructuras celulares. Permeabiliza las células con un detergente no iónico para acceder a las dianas intracelulares.

Agregue faloidina marcada con fluorescencia, que se une a los filamentos de actina.

Coloque el cubreobjetos sobre un medio de montaje que contenga DAPI, que tiñe el ADN.

Observe la Porphyromonas gingivalis fluorescente dentro de las células endoteliales con actina fluorescente, confirmando la internalización bacteriana.

Para visualizar las bacterias internalizadas, primero, transfiera asépticamente cubreobjetos de vidrio esterilizados en autoclave dentro de cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Coloque cinco veces 10 a los cuatro HUVEC por pocillo en el cubreobjetos e incube durante 24 horas. Para etiquetar bacterias, centrifugar bacterias de fase logarítmica media y volver a suspender el pellet con PBS anaeróbico. Centrifugar de nuevo y repetir el paso de lavado.

Agregue 20 microlitros de BCECF-AM de 0,2 milimolares a dos mililitros de PBS anaeróbico que contengan de cinco a siete veces 10 a la octava bacteria por mililitro. Incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos en la oscuridad.

El tinte fluorescente que usamos puede teñir la mayoría de las bacterias anaeróbicas. Por lo tanto, no se requieren otros reactivos, como un anticuerpo específico.

Centrifugar la suspensión bacteriana a 5.000 veces g durante 10 minutos para eliminar el reactivo de etiquetado no ligado y volver a suspender las bacterias en medio VEGF. Luego, infecte las células HUVEC en una proporción de 100 a 1, bacterias a células, e incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, retire el medio de infección y lave las células tres veces con PBS. Luego, agregue paraformaldehído al 4% e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos para fijar las células en la cámara anaeróbica.

Retire las celdas fijas de la cámara y luego lave los cubreobjetos con PBS tres veces. Incube los cubreobjetos en un mililitro de Triton X-100 al 0,2% durante 10 minutos para permeabilizar las células. Luego, lave los cubreobjetos con PBS tres veces. Ahora, agregue 50 microlitros de 50 microgramos por mililitro de faloidina TRITC a cada cubreobjetos e incube durante 45 minutos a temperatura ambiente para teñir la actina oligomérica celular.

Después de la incubación, lave el cubreobjetos con PBS tres veces. Invierta el cubreobjetos en un portaobjetos de vidrio con un medio de montaje suave que contenga un microgramo por mililitro DAPI para tinción nuclear. Luego, selle la periferia del cubreobjetos con esmalte de uñas y observe bajo microscopía confocal.