Visualización de bacterias anaeróbicas internalizadas dentro de las células endoteliales del huésped

Comience con una suspensión de Porphyromonas gingivalis, bacterias patógenas anaeróbicas en crecimiento activo.

Agregue BCECF-AM, un tinte no fluorescente y permeable a las células.

Las esterasas citoplasmáticas activas hidrolizan el tinte en una forma fluorescente e impermeable a las células, tiñendo las bacterias.

centrífuga. Vuelva a suspender las bacterias en medios anaeróbicos.

Agregue las bacterias marcadas a pocillos de placas de pocillos múltiples que contengan cubreobjetos con células endoteliales humanas adheridas.

Incubar en una cámara anaeróbica.

Las fimbrias bacterianas se unen a los receptores de la superficie celular endotelial, iniciando cascadas de señalización intracelular.

Esto conduce a un reordenamiento de actina y a la internalización bacteriana dentro de los fagosomas.

Después de la incubación, lave los cubreobjetos con tampón para eliminar las bacterias no internalizadas.

Fije las células con paraformaldehído para preservar las estructuras celulares. Permeabiliza las células con un detergente no iónico para acceder a las dianas intracelulares.

Agregue faloidina marcada con fluorescencia, que se une a los filamentos de actina.

Coloque el cubreobjetos sobre un