JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 4:29 min • July 8th, 2025
Comience con una placa de pocillos múltiples que contenga una suspensión de Streptococcus pneumoniae.
Introducir anticuerpos bacterianos dirigidos a antígenos de superficie, que interactúan con antígenos bacterianos de superficie. Esto recubre las bacterias con anticuerpos, formando bacterias opsonizadas para el reconocimiento inmunológico.
Siembre los pozos con neutrófilos derivados de linfocitos de sangre periférica humana suplementados con suero de conejo que contenga proteínas del complemento.
Durante la incubación, las proteínas del complemento como C3b se depositan en la superficie bacteriana, lo que lleva a un recubrimiento adicional de opsonina en las bacterias opsonizadas con anticuerpos, lo que mejora el reconocimiento bacteriano por parte de los neutrófilos.
Los receptores de superficie específicos de los neutrófilos interactúan con las opsoninas de las bacterias, facilitando la absorción bacteriana a través de la fagocitosis.
Dentro del fagosoma, los neutrófilos degradan las bacterias engullidas, reduciendo el recuento de bacterias en el tampón.
Después de la incubación, coloque la solución de cocultivo diluida en una placa de agar de sangre para permitir que las bacterias individuales formen colonias.
Compare el número de colonias en bacterias tratadas con opsonina con bacterias no tratadas.
Menos colonias con tratamiento con opsonina indican una mayor muerte bacteriana, lo que sugiere una muerte opsonofagocítica exitosa.
Descongele un tubo de caldo bacteriano. Pellet de bacterias a 6.000 veces g durante dos minutos, y resuspender el pellet celular en OBB a la dilución óptima obtenida en el paso anterior. Pipetear 10 microlitros de la dilución bacteriana resuspendida por pocillo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos de fondo redondo. Luego, agregue 20 microlitros de un anticuerpo apropiado o un tratamiento farmacológico a cada pozo experimental por duplicado.
Para pocillos de control, use 1X PBS u OBB, según el tampón utilizado para los pocillos de tratamiento. Agite la placa de muestra a aproximadamente 90 RPM a temperatura ambiente durante una hora.
Para cosechar las células diferenciadas por HL60 que se tratan con DMF tres días antes, granular las células a 500 veces g durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y lave el gránulo con al menos 10 mililitros de 1XPBS. Peletizar las células lavadas a 500 veces g durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en OBB.
Agregue suero estéril de conejo bebé sin diluir en un volumen final de uno a cinco. Después de un cultivo bacteriano de una hora, divida cada muestra en pocillos duplicados para dos grupos. A continuación, agregue 50 microlitros de la mezcla de complemento HL60 a cada conjunto experimental de pocillos y 50 microlitros de OBB solo a los pocillos de bacterias. Agite la placa de 96 pocillos a 37 grados centígrados durante una hora.
Para enchapar las muestras, diluya cada pocillo con OBB a un volumen final de uno a cinco para que cada muestra tenga un volumen de al menos 50 microlitros. A continuación, pipetee 50 microlitros de cada muestra directamente en un área designada de una placa de cultivo bacteriano, asegurando un espacio adecuado entre las muestras. Cubra y deje que las muestras se sequen durante aproximadamente 15 minutos a temperatura ambiente.
Invierta las placas y cultive durante la noche a 30 grados centígrados. Alternativamente, cultive placas en frascos anaeróbicos, para probar si las condiciones anóxicas afectan el crecimiento bacteriano o para controlar la morfología. Después del cultivo durante la noche, cuente las colonias en cada área de muestra designada y proceda a analizar los datos comparando el número de células vivas en cada conjunto con los controles correspondientes.
Los aspectos más difíciles de establecer esta técnica por primera vez probablemente serán la optimización de las UFC iniciales del stock bacteriano, así como garantizar que las células HL60 se diferencien de manera efectiva.