Una técnica para evaluar la localización in vivo de anticuerpos específicos contra tumores

Tome una suspensión de células de cáncer de ovario humano. Agregue un medio de matriz de membrana basal y manténgalo en hielo para evitar la formación de gel.

Cargue la mezcla en una jeringa e inyecte por vía subcutánea en un ratón desnudo atímico. Retire la aguja una vez que la matriz se gelifique, evitando la expulsión de la mezcla.

La falta de una respuesta inmune en el ratón inmunodeficiente preserva la viabilidad de las células inyectadas. Las proteínas de la matriz extracelular y los factores de crecimiento del gel proporcionan señales que promueven el crecimiento, lo que facilita la formación de tumores.

Las células tumorales sobreexpresan el receptor de folato alfa-1 unido a la superficie o FOLR1.

Tome anticuerpos específicos de FOLR1. Agregue un tinte fluorescente e incube, permitiendo la conjugación del tinte con los anticuerpos.

Inyecte por vía intravenosa los anticuerpos marcados en el ratón portador de tumor anestesiado.

Los anticuerpos llegan al tumor a través de la circulación y se unen a FOLR1 en las células tumorales, marcando fluorescentemente la superficie celular.

Realice imágenes de fluorescencia in vivo. Tras la excitación, el colorante emite fluorescencia, lo que facilita la evaluación de la localización de anticuerpos en el tumor.

Diálice 0,5 mililitros del anticuerpo utilizando un casete de diálisis en 1 litro de tampón de conjugación. Después de cuatro horas, transfiera el casete de diálisis a un tampón nuevo y dialícelo durante la noche. Para configurar una reacción de conjugación, agregue 0,03 microgramos de IRDye 800CW por 1 miligramo de anticuerpo en un volumen total de 500 microlitros.

Incube la mezcla durante dos horas a 20 grados centígrados. Luego, purifique los conjugados marcados mediante diálisis extensa contra PBS. Estime el grado de etiquetado midiendo la absorbancia del colorante a 780 nanómetros y la absorbancia de la proteína a 280 nanómetros.

Para desarrollar xenoinjertos de ratón, levante suavemente la piel del animal y sepárela de la capa muscular subyacente. Inyecte lentamente 100 microlitros de suspensión celular debajo de la piel con una aguja de calibre 26. Espere unos segundos antes de sacar la aguja para que el medio de la matriz basal pueda formar una estructura similar a un gel semisólido junto con las células debajo de la piel, lo que evitará que la mezcla salga del lugar de la inyección.

Para realizar imágenes in vivo, inyecte el anticuerpo marcado con tinte a través de la vena de la cola. Después de anestesiar al ratón, verifique la falta de respuesta a los reflejos del pedal y dilate la vena aplicando agua tibia. Use una jeringa de insulina de 1 CC con una aguja de calibre 26 para inyectar 25 microgramos del anticuerpo marcado en un volumen de 100 microlitros. Como control negativo, etiquete e inyecte el anticuerpo isotipo IgG no específico que no se dirige a las células cancerosas.

Realice imágenes in vivo 8, 24 y 48 horas después de las inyecciones de anticuerpos. En el software de creación de imágenes, haga clic en Inicializar. Confirme que la temperatura de la etapa sea de 37 grados centígrados. En el panel de control, configure las imágenes de fluorescencia a través del asistente de imágenes y configure la excitación en 773 nanómetros y la emisión en 792 nanómetros.

Transfiera el ratón anestesiado a la cámara de imágenes y colóquelo en el campo de imágenes usando el cono de la nariz. Cuando esté listo, haga clic en Adquirir en el panel de control para la adquisición de imágenes y haga clic en Exposición automática. La imagen generada es la superposición de la fluorescencia en la imagen fotográfica, con la intensidad de fluorescencia óptica mostrada en unidades de recuentos o fotones.