JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 3:18 min • July 8th, 2025
Comience con las subpoblaciones de macrófagos M1 y M2 adherentes, que se distinguen por sus marcadores de superficie específicos. Estas células están infectadas con Mycobacterium tuberculosis marcada con fluorescencia.
Agregue la zona de influencia FACS a los pocillos de cultivo.
El EDTA en el tampón permite el desprendimiento celular de los pocillos de cultivo.
Transfiera la suspensión celular a tubos de microcentrífuga.
Centrifugar los tubos. Deseche el sobrenadante. Resuspenda las células en un cóctel de anticuerpos antimacrófagos conjugado con fluorocromo y un tinte de viabilidad, Zombie-UV.
El colorante de fluorescencia Zombie-UV ingresa a las células muertas a través de membranas dañadas y se une a las proteínas citoplasmáticas, lo que permite una clara diferenciación de las células viables sin teñir.
Además, los anticuerpos antimacrófagos conjugados con fluorescencia se unen a los antígenos diana en los macrófagos, lo que permite la detección diferencial de subpoblaciones.
Lave las células para eliminar los anticuerpos no unidos. Centrífuga. Retire el sobrenadante.
Vuelva a suspender las células en un tampón fijador para reticular proteínas, preservando la morfología celular e inactivando las micobacterias para un manejo seguro durante el análisis.
Finalmente, centrifugar y procesar las muestras para citometría de flujo.
Utilice una estrategia de compuerta adecuada para determinar el porcentaje de subpoblaciones infectadas por Mycobacterium.
Para teñir las células para citometría de flujo, incube las células infectadas con 1 mililitro de tampón FACS suplementado con EDTA 0,5 milimolares por pocillo durante al menos 30 minutos. Al final de la incubación, recoja las células separadas con un pipeteo suave y transfiéralas a tubos de microcentrífuga individuales con tapa de rosca para su centrifugación.
Vuelva a suspender las células en aproximadamente 50 microlitros de cóctel de anticuerpos antihumanos conjugados con fluorocromo y colorante de viabilidad de interés, e incube las células durante 30 minutos a 4 grados centígrados protegidas de la luz.
Después del lavado, fije las células con 200 microlitros de tampón de fijación recién preparado durante 30 minutos a temperatura ambiente protegido de la luz. Después de la fijación y el lavado, vuelva a suspender las células en 400 microlitros de tampón FACS y transfiera las células a tubos de microcentrífuga de 1 mililitro.
Para analizar las células, use perlas de compensación para compensar la señal fluorescente para cada anticuerpo conjugado con fluorocromo en el cóctel y use células sin teñir para establecer la puerta para la población de células negativas. Luego, adquiera un mínimo de 50,000 células por muestra.