Ensayo in vitro para estudiar la capacidad citotóxica de las células asesinas inducidas por citocinas

Tome un cultivo de células cancerosas con proteínas citoplasmáticas marcadas con fluorescencia.

Agregue células asesinas o CIK inducidas por citoquinas, células T efectoras con características similares a las células asesinas naturales, que poseen actividad antitumoral.

Los receptores D o NKG2D del grupo 2 de asesinos naturales en las células CIK se unen a proteínas inducibles por estrés en las células cancerosas.

La unión induce a las células CIK a liberar toxinas de gránulos citoplasmáticos: perforinas y granzimas.

Las perforinas forman poros en la membrana celular cancerosa, permitiendo la entrada de granzimas, que activan las caspasas, induciendo la apoptosis.

Después de la incubación, recolecte las células. Agregue un tinte fluorescente de viabilidad celular de unión a ácidos nucleicos.

El tinte ingresa a través de la membrana celular dañada y se une al ADN, lo que da como resultado células muertas con doble tinción.

Con una membrana celular intacta, las células vivas son impermeables al tinte.

Pasar las células a través de un citómetro de flujo para detectar células vivas que muestran fluorescencia única y células muertas con fluorescencia dual.

Cree un diagrama de dispersión para medir el porcentaje de células cancerosas muertas, cuantificando el efecto citotóxico de las células CIK.

Para realizar el ensayo citotóxico, cocultivo de células CIK y leucemia mieloide crónica humana K562, agregando 1 mililitro de células K562 a cada pocillo en una placa de 6 pocillos a una densidad de 0,5 millones de células por mililitro. Luego, agregue 1 mililitro de medio basal con o sin células CIK a la placa de 6 pocillos, como se indica en el protocolo de texto. Mezcle las suspensiones celulares pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces.

Coloque la placa en la incubadora durante 24 horas. Ahora, cocultive células CIK y OC-3 ováricas agregando 1 mililitro de medio basal con o sin células CIK a la placa de 6 pocillos, como se indica en el protocolo de texto. Mezcle las suspensiones celulares pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces con la cuchilla en la incubadora durante 24 horas. Después de la incubación, recoja la suspensión celular CIK-K562 directamente en un tubo estéril de 15 mililitros.

Para recolectar tanto la suspensión como las células adherentes de los grupos CIK-OC-3, primero, transfiera la suspensión celular a un tubo estéril de 15 mililitros. Lave bien con 1 mililitro de PBS estéril. Recoja el PBS y agréguelo al tubo. Luego, agregue 0,5 mililitros de solución enzimática de disociación celular e incube durante cinco minutos a 37 grados centígrados.

Agregue 1 mililitro de la solución del mismo tubo al pocillo correspondiente y mezcle suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces con una pipeta estéril de 1 mililitro. Reúna todas las células en el mismo tubo. Centrifugar a 300 x g durante 10 minutos. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 mililitro de PBS estéril. Peletizar las células a 300 x g durante 10 minutos. Luego, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 100 microlitros de PBS estéril.

Agregue 5 microlitros de colorante 7-AAD a la suspensión celular. Mezcle suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces con una pipeta estéril de 1 mililitro. Incubar durante 10 minutos y dejar en la oscuridad antes del análisis.

Para realizar el ensayo de capacidad citolítica, mezcle la suspensión celular y repita la preparación para la citometría de flujo. Haga clic en el botón Nueva muestra para agregar una muestra y un tubo al experimento. Asigne un nombre a las válvulas como se indica en el protocolo de texto.

Para crear un sistema de compuerta de dispersión para el ensayo citolítico, primero, seleccione Tubo 1 y haga clic en el botón Diagrama de puntos. Para crear un gráfico FSC-A/SSC-A, dibuje una puerta rectangular sobre todos los eventos con un umbral FSC-A superior a 50.000 para excluir los residuos celulares. Seleccione el parámetro SSC-A/CFSE para el nuevo diagrama de puntos. A continuación, seleccione el parámetro 7-AAD/CFSE para el nuevo diagrama de puntos y dibuje una puerta de cuatro cuadrantes para definir las cuatro subpoblaciones.

Haga clic en el botón Cargar muestra para analizar primero la muestra de control en blanco. Ajuste el voltaje de SSC-A y FSC-A. Identifique la población de células muertas mediante los parámetros de canal CFSE y 7-AAD. Registre los datos de más de 20,000 células positivas para CFSE en cada muestra. Abra los archivos que contienen los valores estadísticos de cada muestra individual para analizar las poblaciones de células no viables y exporte los datos a archivos de análisis.