Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:40 min. • July 8th, 2025
Tome células leucémicas en medios de crecimiento sin factores estimulantes como citocinas e incube.
La ausencia de factores estimulantes permite que las proteínas fosforiladas intracelulares sufran desfosforilación y vuelvan a sus estados nativos.
Centrifugar y retirar el medio. Resuspender las células en el sobrenadante del estroma que contiene la citocina, la linfopoyetina estromal tímica o TSLP.
TSLP se une a su receptor en la célula leucémica, desencadenando la dimerización del receptor.
Esto acerca las dos quinasas asociadas a Janus, o JAK, lo que facilita la transfosforilación mutua.
Los JAK activados fosforilan las colas citoplasmáticas del receptor, creando sitios de acoplamiento para el transductor de señales y activador de la transcripción, los monómeros STAT.
Una vez fosforilados, los STAT se dimerizan y se separan del receptor para regular los procesos celulares posteriores.
Fijar las células para mantener los estados de fosforilación de las proteínas intracelulares.
Tratar las células con una solución de permeabilización para aumentar la permeabilidad de la membrana celular.
Agregue anticuerpos marcados con fluorescencia para marcar las proteínas fosforiladas.
La medición por citometría de flujo de la señal de fluorescencia se correlaciona con la fosforilación STAT inducida por TSLP.
Para validar el sobrenadante producido a partir del estroma diseñado, descongele las muestras de sobrenadante recolectadas del control en el estroma que expresa citoquinas y coloque en una placa de 3 pocillos de líneas celulares de leucemia por condición en medio R20 a una concentración de 2 veces 10 a la quinta célula por pocillo en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Incube las células durante dos horas a 37 grados centígrados para permitir que se pierda la fosforilación de su cultivo anterior.
Luego, transfiera las células de cada pocillo a tubos individuales de 4 mililitros y recolecte las células por centrifugación. Vuelva a suspender los gránulos en 600 microlitros por condición experimental y coloque 200 microlitros de células por pocillo para cada condición por triplicado. Incubar las células durante el período apropiado de acuerdo con el fosfoensayo comercial específico.
Al final de la incubación, granular las células por centrifugación y etiquetarlas mediante tinción por citometría de fosfoflujo de acuerdo con el protocolo del fabricante. Luego, analice las células mediante citometría de flujo utilizando protocolos estándar de análisis de citometría de flujo para verificar que la citocina en el sobrenadante del estroma fosforila las células leucémicas.