Visualización de bacterias en secciones de biopsia vesical mediante hibridación fluorescente in situ

Comience con un portaobjetos de vidrio que contenga una sección de tejido de biopsia de vejiga urinaria infectada desparafina y rehidratada que contenga bacterias uropatógenas.

Introducir sondas universales marcadas con fluorescencia, un oligonucleótido monocatenario complementario específico para la región conservada del ARN ribosómico bacteriano 16s o ARNr 16s.

Incube el portaobjetos en la oscuridad a una temperatura elevada para una hibridación óptima.

Durante la incubación, las sondas se hibridan exclusivamente con la región conservada en el ARNr bacteriano 16s, impartiendo fluorescencia verde a las bacterias.

Después de la hibridación, lavar con un tampón precalentado para eliminar las sondas sueltas.

Tiña la sección de tejido con colorante Hoechst y marcadores de proteínas celulares marcados con fluoróforo.

Las moléculas de Hoechst se unen al ADN, tiñendo los núcleos de azul, mientras que los marcadores marcados con fluoróforo interactúan con componentes celulares específicos como filamentos de mucina y actina, impartiendo fluorescencia roja en la sección de biopsia.

Lave el portaobjetos y agregue medios de montaje a la sección de tejido.

Bajo un microscopio confocal, la fluorescencia verde dentro de la sección de biopsia de vejiga portadora de fluorescencia roja confirma las bacterias asociadas al tejido.

Prepare una cámara humidificadora para cada sonda agregando una toallita de trabajo delicada, arrugada y empapada y agua estéril al depósito de una caja de puntas P1000. Coloque el cartucho del soporte de la punta en la parte superior, ya que aquí es donde se asentarán las correderas. Cuando se complete el lavado final, retire el portaobjetos de la rejilla para portaobjetos y colóquelos sobre una toalla de papel nueva, con el pañuelo hacia arriba. Use una toallita de tarea delicada para secar el portaobjetos, teniendo cuidado de frotar suavemente cerca pero no en la sección de biopsia para eliminar el agua. Con un bolígrafo hidrofóbico, dibuje un borde alrededor de la sección de biopsia y coloque el portaobjetos con el tejido hacia arriba en la cámara de humidificación.

A continuación, coloque la cámara de humidificación en una incubadora a 50 grados centígrados. Pipetee entre 50 y 150 microlitros de la solución de tinción directamente sobre el tejido para que se llene el rectángulo formado por el borde hidrofóbico alrededor del tejido, y cierre la caja suavemente. Incube durante la noche a 50 grados centígrados en la oscuridad. Si la incubadora tiene una ventana, cúbrala con papel de aluminio para crear un ambiente oscuro.

A la mañana siguiente, retire los portaobjetos de las cámaras de humidificación y elimine rápidamente cualquier solución de hibridación restante con una toallita delicada. Luego, coloque los portaobjetos en una rejilla de tinción vertical. Coloque la rejilla de tinción en un frasco de coplin envuelto en papel de aluminio que contenga 100 ml del tampón de lavado precalentado durante 10 minutos. Repita este paso de lavado dos veces más con un tampón de lavado nuevo en frascos de coplin nuevos.

Durante estos pasos de lavado, prepare la contramancha diluyendo una solución madre de Hoechst 33342 en tampón de lavado en una proporción de 1 a 1.000. Al mismo tubo, agregue la aglutinina de germen de trigo Alexa-555 a una concentración final de cinco microgramos por mililitro y la faloidina Alexa-555 a una concentración final de 33 nanomolares. Almacene en la oscuridad hasta que esté listo para usar.

Cuando se complete el lavado final, retire los portaobjetos del frasco de coplin y elimine suavemente el exceso de tampón de lavado con una toallita de tarea delicada. Coloque los portaobjetos con el pañuelo hacia arriba sobre una toalla de papel y agregue entre 50 y 150 microlitros de contratinción directamente sobre el tejido para que el borde hidrofóbico se llene pero no se desborde. Cubra hasta cuatro portaobjetos con una tapa de caja criogénica e incube a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Después de esto, vuelva a colocar los portaobjetos en la rejilla de tinción y lávelos dos veces más en frascos de coplin que contengan tampón de lavado fresco, y cada lavado durará 10 minutos. Luego, seque bien los portaobjetos y colóquelos con el pañuelo hacia arriba sobre una toalla de papel debajo de la tapa de una caja criogénica. Apriete una gota de medios de montaje directamente sobre el pañuelo y coloque suavemente un cubreobjetos del tamaño adecuado en la parte superior. Con cuidado, presione las burbujas y deje que los portaobjetos cubiertos se curen durante la noche en la oscuridad. Al día siguiente, selle los bordes de los cubreobjetos al portaobjetos con una capa ligera de esmalte de uñas transparente y déjelos secar en la oscuridad durante 10 minutos, antes de guardarlos en la oscuridad a 4 grados centígrados.

Cuando esté listo para obtener imágenes de las biopsias teñidas, encienda el microscopio confocal y el software asociado con el microscopio. Comience con una diapositiva positiva FISH y cambie al modo de visualización por computadora. Seleccione los canales para 405, 488 y 555. Establezca el estenopeico usando el canal de longitud de onda más largo, que en este caso es 555. Luego, encuentre el plano focal actual para la visualización de bacterias marcadas en el canal 488. Sin cambiar el plano focal, establezca la ganancia, la potencia del láser y el desplazamiento para cada canal, de modo que la señal no esté saturada y el fondo no se corrija en exceso. Adquiere la imagen en los tres canales.