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Inmunología
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Tome una suspensión de células Jurkat: células leucémicas de linfocitos T.
Mezclar una alícuota con un colorante de viabilidad celular y asegurar un número adecuado de células vivas.
Coloque las células en una placa de cultivo y aplique radiación ultravioleta C o UVC durante el tiempo requerido.
La UVC penetra en las células y es absorbida por el ADN, formando fotoproductos de pirimidina.
Después de la irradiación, incubar las células. El daño extenso del ADN mediado por UVC inicia la vía de apoptosis intrínseca, activando proteínas proapoptóticas en la membrana mitocondrial externa.
Las proteínas activadas se oligomerizan, formando poros de membrana y liberando citocromo C del espacio intermembrana al citoplasma.
Complejos de citocromo C con el factor activador de proteasa apoptótica-1, formando un complejo de apoptosomas. El apoptosoma activa las caspasas, causando apoptosis.
Introduzca anexina V marcada con fluoróforo para marcar la fosfatidilserina en la membrana, un marcador celular apoptótico, y agregue yoduro de propidio que ingresa a través de la membrana dañada para marcar el ADN.
Mediante citometría de flujo, determine las células apoptóticas tempranas marcadas con anexina V y las células apoptóticas tardías teñidas con dualidad.
Comience cultivando células T Jurkat en medio de cultivo de células basales, complementado de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Las células T de Jurkat son una línea celular en suspensión que se puede mantener mediante el paso a medios de cultivo precalentados cada tres días.
Prepare las células apoptóticas haciéndolas crecer hasta un 90% de confluencia, lo que demora de tres a cuatro días después de pasar. Cultivar células en cinco matraces T75, para obtener un número suficiente de células para este protocolo. Una vez que las células estén listas, aspire el contenido del matraz unos 24 mililitros y transfiéralo a un tubo cónico de 50 mililitros. Cuente las células con tinción de azul de tripano y un hemocitómetro.
Granular las células por centrifugación a 271 veces g durante cinco minutos y desechar el sobrenadante. Luego, vuelva a suspender las células en el medio para obtener tres millones de células por mililitro. Alícuotas de las células en placas de cultivo de tejidos de 100 por 20 milímetros transfiriendo cinco mililitros de células por placa.
Prepare aproximadamente nueve platos de cultivo. Deje un plato a un lado como control no expuesto y exponga los platos restantes a los rayos UV. Ajuste el reticulante UV al nivel de energía correcto presionando el botón de energía e ingresando "600" con el teclado numérico. Irradie todas las placas con las células excepto el control, asegurándose de quitar la cubierta superior de la placa de cultivo de tejidos durante la exposición a los rayos UV.
Luego, incube todas las placas en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante cuatro horas. Después de la incubación, combine todas las células irradiadas en un tubo cónico de 50 mililitros y gránulas por centrifugación a 271 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 24 mililitros de PBS estéril. Centrifuga el tubo nuevamente y retira el sobrenadante.