Análisis de la activación de basófilos en presencia de un alérgeno de prueba mediante citometría de flujo

Tome tubos de citómetro que contengan una mezcla de tinción que comprenda anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia suspendidos en un tampón de estimulación.

Agregue concentraciones decrecientes del alérgeno de prueba en varios tubos. Agregue anticuerpos anti-IgE a un tubo para que sirva como control positivo mediado por IgE y agregue tampón a otro tubo para el control negativo.

Pipeta sangre periférica humana en los tubos. Incubar.

Si el individuo está sensibilizado al alérgeno de prueba, esta exposición hace que el alérgeno se una a los anticuerpos IgE específicos del alérgeno unidos a los receptores Fc en la superficie del basófilo.

Los alérgenos reticulan los receptores de Fc unidos a IgE, lo que provoca la activación de los basófilos.

Los basófilos sufren desgranulación, liberando gránulos intracelulares que contienen mediadores inflamatorios, con la regulación positiva de las moléculas CD63 y CD203c.

Los anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia se unen a CD63, CD203c y CCR3 en basófilos, respectivamente.

Baje la temperatura para detener la desgranulación de basófilos.

Agregue tampón para lisar eritrocitos y fijar las células.

Usando un citómetro de flujo, identifique los basófilos de la población de linfocitos.

Usando CD63 como marcador de activación, analice la activación de basófilos a concentraciones decrecientes de alérgenos.

Comience recolectando sangre periférica en tubos heparinizados de 9 mililitros y coloque las muestras en un rotor para mantenerlas a temperatura ambiente hasta que sean necesarias para el protocolo experimental.

Etiquete dos tubos de citómetro de 5 mililitros cada uno para el control negativo y el control positivo. Además, etiquete un tubo para cada una de las diferentes concentraciones de alérgenos o medicamentos que se están probando. Luego, coloque los tubos en una rejilla para que los tubos encajen perfectamente sin resbalar.

Para el primer control positivo, prepare una solución de 4 micromolares de N-formilmetionil-leucil-fenilalanina, o fMLP, en PBST al 0,05% para confirmar la calidad de los basófilos. Para el segundo control positivo, prepare una solución anti-IgE de 0,05 miligramos por mililitro con PBST. Prepare la mezcla de tinción agregando 1 microlitro de anticuerpos CCR3-APC, CD203c-PE y CD63-FITC por cada 20 microlitros del tampón de estimulación. Luego, agregue 23 microlitros de esta mezcla de tinción a cada tubo.

Agregue 100 microlitros de PBST a los tubos de control negativo, agregue 100 microlitros de fMLP a uno de los tubos de control positivo y agregue 100 microlitros de anti-IgE al otro. Al resto de tubos, agregue 100 microlitros de las diferentes concentraciones de alérgenos o medicamentos, e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de la incubación, agregue 100 microlitros de sangre a cada tubo suavemente para evitar la hemólisis. Luego, agite suavemente los tubos e incube durante 25 minutos a 37 grados centígrados en el baño termostático con agitación media.

Mantenga los tubos a 4 grados centígrados durante al menos cinco minutos para detener la desgranulación. A cada tubo, agregue 2 mililitros de tampón de lisis para lisar los eritrocitos. Agite cada tubo en vórtice y luego incube los tubos durante 5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar los tubos a 300 x g a 4 grados centígrados durante 5 minutos. Luego, volque la rejilla en el fregadero para decantar el sobrenadante mientras las celdas permanecen en la parte inferior de los tubos. Agregue 3 mililitros de PBST a cada tubo para lavar las células y agitar los tubos. Realice una segunda ronda de centrifugación utilizando el mismo conjunto de parámetros y decantar el sobrenadante volcando la rejilla en el fregadero. Luego, mantenga las muestras a 4 grados centígrados, protegidas de la luz hasta la citometría de flujo.

Conecte el citómetro de flujo al software de la computadora y espere hasta que el citómetro esté listo. Cargue la plantilla y la configuración del instrumento como se describe en el manuscrito de texto. Inicie el proceso de adquisición de muestras.

Para seleccionar basófilos activados, primero, obtenga los linfocitos del gráfico de dispersión lateral - dispersión directa. Luego, obtenga los basófilos de la población de linfocitos como células CD203c positivas para CCR3 y adquiera al menos 500 basófilos por tubo. Establezca el umbral negativo para CD63 en aproximadamente 2,5% utilizando los tubos de control negativo y analice las muestras.