Seguimiento de leucocitos basado en fotoconversión en pez cebra transgénico infectado por bacterias

Comience con un plato que contenga larvas de pez cebra transgénicas anestesiadas e incrustadas en agarosa que expresan la proteína fluorescente fotoconvertible en sus leucocitos: células inmunes fagocíticas.

La vesícula ótica izquierda, preinyectada con bacterias marcadas con tinte fluorescente rojo, se coloca plana contra el fondo del plato.

Dentro de la vesícula ótica, las bacterias preinyectadas causan una infección local, desencadenando la migración de células inmunes y la liberación de quimiocinas, lo que provoca la infiltración de leucocitos en la vesícula ótica.

Bajo un microscopio de fluorescencia, observe el reclutamiento inicial de leucocitos verdes y la fagocitosis de bacterias rojas por leucocitos en el sitio de la infección.

Iluminar la vesícula ótica con una longitud de onda de 405 nanómetros, transformando irreversiblemente la proteína fluorescente fotoconvertible de verde a rojo e impartiendo fluorescencia roja a los leucocitos, lo que permite su visualización distinta y un seguimiento preciso.

Ahora, examine las larvas en dos longitudes de onda diferentes a varias profundidades, lo que permite la visualización de los leucocitos de fluorescencia roja fotoconvertida y verde restante.

Los leucocitos rojos fotoconvertidos se dispersan desde las vesículas óticas y se dispersan por todo el cuerpo, lo que facilita el seguimiento de los leucocitos basado en la fotoconversión.

Después de preparar agarosa con tricaína de acuerdo con el protocolo de texto en la platina del microscopio estereoscópico, use una pipeta de transferencia para colocar de cuatro a cinco larvas anestesiadas en un plato con fondo de vidrio. Retire la solución de tricaína y agarosa del baño de agua a 55 grados Celsius y déjela enfriar a temperatura ambiente durante 1 a 2 minutos.

Mientras tanto, elimine la mayor cantidad de líquido posible de las larvas anestesiadas. A continuación, vierta la agarosa enfriada en el plato hasta cubrir aproximadamente la mitad de la superficie. Luego, agite el plato para esparcir la agarosa. Recoja las larvas que hayan flotado a los lados del plato y pipetee de nuevo en el centro. Luego, bajo el microscopio estereoscópico, use una punta de pipeta larga para colocar suavemente las larvas como desee.

Para obtener imágenes de la vesícula ótica, coloque las larvas de modo que la vesícula ótica derecha quede hacia arriba y la vesícula ótica izquierda quede plana contra el fondo del plato. Deje enfriar la agarosa durante unos 10 minutos antes de mover el plato. Luego, pipetea suavemente un poco de tricaína y solución E3 sobre la capa de agarosa para mantenerla húmeda.

Para visualizar las muestras, utilice un escaneo de pila z con láseres de 488 nanómetros y 543 nanómetros. Utilice el escaneo de línea continuo para ajustar la potencia del láser y la ganancia del detector. Verifique que no haya fluorescencia roja fotoconvertida accidentalmente. En la ventana "Control de adquisición de imágenes", en "Configuración de estímulo", seleccione la herramienta "Usar escáner" y elija "Principal". Seleccione el láser de 405 nanómetros y configúrelo al 70% de potencia. Luego, usando la opción de círculo, defina la región de interés en la vesícula ótica.

En la configuración "Inicio de estímulo ", seleccione "Activación en serie" con una preactivación de 1 fotograma y un tiempo de activación de 60.000 milisegundos. En la ventana "Configuración de adquisición", bajo el encabezado "Escaneo de tiempo", elija dos intervalos de minutos, cada uno para la conversión previa y otro para la conversión posterior a la foto. Inicie la serie de lapso de tiempo para iniciar la fotoconversión de la región de interés definida. Finalmente, escanee la muestra usando una pila z y los láseres de 488 y 543 nanómetros para visualizar la fluorescencia roja fotoconvertida, así como cualquier fluorescencia verde restante.