Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
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Tome un tubo que contenga sangre humana recién extraída y agregue un tampón de lisis.
El detergente en el tampón permeabiliza la membrana celular, lisando las células y liberando ácidos nucleicos intracelulares, o NA, y nucleasas.
Los agentes caotrópicos en el tampón desnaturalizan las nucleasas, evitando la degradación de NA.
Agregue partículas magnéticas de vidrio o MGP (partículas magnéticas recubiertas de sílice) y mezcle bien.
El bajo pH del tampón protona sílice, lo que genera una carga positiva en la superficie de los MGP.
Los NA cargados negativamente se unen electrostáticamente a la superficie cargada, formando un complejo NA-MGP.
Bajo un campo magnético, los complejos NA-MGP se acumulan en el costado del tubo.
Deseche el sobrenadante que contiene restos celulares y proteínas.
Realice múltiples pasos de lavado resuspendiendo los complejos NA-MGP en un tampón de lavado, aplicando un campo magnético para recolectar los complejos y desechando el sobrenadante con los contaminantes restantes.
Vuelva a suspender complejos en un tampón de elución. El pH alto interrumpe la interacción NA-MGP, liberando los NA. Los NA eluidos están listos para los ensayos posteriores.
Para purificar los ácidos nucleicos de la sangre recolectada, mezcle nuevamente el contenido del tubo volteando el tubo de vacío con la mano de 5 a 10 veces. Vierta la alícuota preparada de MGP directamente en el tubo de extracción de sangre, luego, coloque una nueva tapa de un tubo de extracción de sangre no utilizado en el tubo que contiene la muestra. Coloque un dedo en la tapa para asegurarse de que el tubo esté bien cerrado y mezcle el contenido del tubo volteándolo de 5 a 10 veces.
Coloque el tubo en el soporte magnético y mantenga un dedo en la tapa para asegurarse de que el tubo esté bien cerrado. Luego, voltee el soporte magnético con el tubo varias veces para dispersar los MGP antes de que se acumulen en el costado del tubo con el imán. Retire la tapa del tubo y deseche el contenido del tubo en un tubo de recolección de 50 mililitros con una pipeta desechable.
Vierta la alícuota preparada de WB1 directamente en el tubo de extracción de sangre y cierre la tapa del tubo. Mezcle el contenido a mano de 5 a 10 veces. Luego, recoja las perlas en el costado del tubo con el imán y retire el líquido como antes. Vuelva a suspender las cuentas en la alícuota preparada de WB2. Luego, deseche la solución y repita el procedimiento con la alícuota preparada de WB3.
Finalmente, retire el tubo del soporte magnético y vierta la alícuota preparada de EB directamente en el tubo de extracción de sangre. Coloque la tapa en el tubo y vuelva a suspender los MGP golpeando de 5 a 10 veces con un dedo. Por último, utilice una pipeta desechable de 1,5 mililitros para transferir una gota de los MGP resuspendidos a la mezcla de reacción de amplificación de ácidos nucleicos aguas abajo.