Imágenes de superresolución de la formación de sinapsis inmunológica de células NK en una bicapa lipídica soportada

Prepare un portaobjetos de cámara con una bicapa lipídica soportada, o SLB, compuesta de fosfolípidos y fosfolípidos biotinilados.

Agregue proteínas bloqueadoras para evitar interacciones no específicas.

Introducir estreptavidina, que se une a los fosfolípidos biotinilados.

Agregue anticuerpos anti-CD16 marcados con fluorescencia biotinilados, que se unen a la estreptavidina inmovilizada.

Pipetear D-biotina para evitar la unión no específica de la estreptavidina a las células.

Introduzca células asesinas naturales o NK. Los receptores CD16 de estas células se unen específicamente a los anticuerpos anti-CD16 unidos a SLB, formando una sinapsis inmunológica.

Esta unión desencadena el reordenamiento de actina y la polarización de los microtúbulos, formando finalmente microgrupos en el centro de la sinapsis que contienen anticuerpos anti-CD16 unidos a SLB y receptores CD16.

Los gránulos líticos que contienen perforina se polarizan y penetran a través de filamentos de actina en la sinapsis.

Arregla las celdas. Permeabilizar las membranas y SLB.

Agregue faloidina y anticuerpos anti-perforina marcados con fluorescencia, que se unen a los filamentos de actina y perforina, respectivamente.

Usando un microscopio de fluorescencia de superresolución, visualice la distribución de filamentos de actina fluorescente y gránulos positivos para perforina en la sinapsis.

Para ensamblar la bicapa lipídica plana soportada por vidrio, primero, prepare 100 mililitros de solución de piraña mezclando peróxido de hidrógeno al 30% con ácido sulfúrico en una proporción de 1 a 3 en un vaso de precipitados. En esta solución, coloque dos cubreobjetos rectangulares #1.5 durante 20 a 30 minutos. Mientras se limpian los cubreobjetos, recupere un tubo de lípidos DOPC de 400 micromolares previamente preparados y un tubo de lípidos de biotina-PE de 80 micromolares previamente preparados. Transpórtalos en hielo al tanque de argón.

Después de desoxigenar un nuevo tubo de microcentrífuga con argón, agregue el DOPC y la biotina-PE en una proporción de 1 a 1. El volumen específico variará según las necesidades experimentales, pero debe ser, como mínimo, de 2 microlitros cada uno. Desoxigenar el tubo de mezcla y los tubos de reactivos individuales antes de devolver estos últimos al frigorífico.

Una vez que hayan terminado de limpiar, enjuague bien los cubreobjetos con agua destilada. Deje que los cubreobjetos se sequen al aire durante unos minutos. Luego, retire 1,5 microlitros de la mezcla de liposomas y alícuotas en una sola gota en una de las cámaras de carril de un portaobjetos de cámara. El uso de dos caídas por carril es típico pero no necesario.

Ahora, coloque rápida y eficientemente el cubreobjetos seco sobre las gotas. Asegúrese de que las gotas estén lo suficientemente espaciadas para que no se fusionen una vez colocado el cubreobjetos. Además, asegúrese de que las gotas permanezcan circulares y bien definidas, sin tocar los bordes de las paredes de la cámara. Presione hacia abajo firmemente, entre y alrededor de cada carril, para garantizar un sello hermético entre el cubreobjetos y la corredera.

Marque las posiciones de las gotas con un rotulador. Luego, pase 100 microlitros de caseína acuosa al 5% a través de la cámara para bloquear la bicapa. Trate de asegurarse de que no haya burbujas en la cámara de flujo. Luego, inyecte 100 microlitros de estreptavidina a una concentración de 333 nanogramos por mililitro en cada carril.

Después de incubar durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente, lavar con 3 mililitros de solución salina tamponada con HEPES con albúmina sérica humana al 1% a través de cada carril para eliminar el exceso de estreptavidina. Agregue 100 microlitros de anti-CD16 biotinilado y marcado con fluorescencia a la concentración de proteína previamente determinada, como se describe en el protocolo de texto.

Después de la incubación en la oscuridad durante 20 a 30 minutos, lávese nuevamente pasando 3 mililitros de solución salina tamponada con HEPES con albúmina sérica humana al 1% en cada carril. Luego, fluya 100 microlitros de D D-biotina a una concentración de 25 nanomolares a través de la cámara para unirse a cualquier exceso de estreptavidina y, por lo tanto, eliminar la posibilidad de unión inespecífica de la estreptavidina a las células.

A continuación, cuente las células NK humanas y vuelva a suspenderlas a una concentración de 500.000 por mililitro en solución salina tamponada con HEPES con albúmina sérica humana al 1%. Lave la D-biotina de la cámara con otros 3 mililitros de solución salina tamponada con HEPES con albúmina sérica humana al 1% por carril. Una vez que las células se hayan resuspendido a la concentración deseada, agregue 100 microlitros a cada carril. Coloque la cámara en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante 30 a 60 minutos.

Después de este período de incubación, fije las células con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos. Lave pasando 3 mililitros de solución salina tamponada con fosfato a través de cada carril para eliminar el paraformaldehído. Luego, agregue 400 microlitros de tampón de bloqueo antes de incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

A continuación, tiñe la F-actina y la perforina añadiendo 200 microlitros de faloidina diluida marcada con fluorescencia y anticuerpo monoclonal anti-perforina marcado con fluorescencia. Incube a temperatura ambiente durante una hora antes de lavar pasando 3 mililitros de solución salina tamponada con fosfato a través de la cámara. La cámara está lista para la obtención de imágenes.

Para comenzar, encienda todos los módulos de hardware necesarios del microscopio STED. Inicie el software de análisis de imágenes y habilite los módulos de escaneo resonante y STED. Después de hacer estas selecciones, espere de tres a cinco minutos para que se inicie el software.

Haga clic en la pestaña Configuración en la parte superior de la pantalla. Seleccione Configuración láser. Luego, encienda la luz blanca y los láseres STED de 592 nanómetros. Elija el objetivo de 100X y alinee el rayo láser de excitación con un láser de agotamiento de 592 nanómetros. Seleccione el módulo Laser Config. Apague el láser de agotamiento 592 y encienda el láser de agotamiento de 660 nanómetros.

Coloque el portaobjetos sobre el platillo sobre la lente. Enfoque las células unidas en la región bicapa demarcada con la lámpara de luz blanca y los oculares. A continuación, vuelva a la pestaña Adquisición directamente a la derecha de la pestaña Configuración. Haga clic en la pestaña Cambiar a luz blanca y, a continuación, encienda ese módulo y arrastre la línea del láser de excitación a la longitud de onda adecuada.

Después de seleccionar el detector deseado y establecer el rango de detección, haga clic en el botón Secuencial en la barra de herramientas Adquirir de la izquierda para abrir el cuadro de diálogo de escaneo secuencial en la parte inferior de la barra de herramientas de la izquierda. Esto permite al usuario agregar múltiples secuencias, cada una con un haz de excitación diferente para un color diferente. Haga clic entre fotogramas y, a continuación, establezca la frecuencia de excitación, el detector y el rango de detección para cada color adicional. Una vez que todas las configuraciones estén optimizadas, presione Iniciar para comenzar el proceso de adquisición.