Preparación a base de agarosa de cortes de pulmón humanos cortados con precisión

Comience con un pulmón humano resecado.

Inserte un tubo de silicona en el bronquio principal del pulmón. Asegure el tubo, proporcionando una vía para introducir agarosa en el tejido en los pasos posteriores.

Sujete otros bronquios y vasos para evitar fugas de agarosa durante el llenado.

Introducir agarosa de baja gelificación precalentada mezclada con medios en el pulmón hasta que esté completamente inflado.

Coloque el pulmón sobre hielo para la polimerización de agarosa, formando una matriz de gel sólido que proporciona estabilidad al tejido y mantiene la arquitectura pulmonar durante los procedimientos de corte.

Después de la polimerización, corte el tejido pulmonar en losas uniformes. Extraiga núcleos de tejido cilíndricos de las losas de tejido.

Con una cortadora de tejidos llena de tampón refrigerado, corte el núcleo del tejido para obtener cortes de pulmón cortados con precisión.

Transfiera las rodajas a una placa de cultivo que contenga medios fríos. Incubar para estabilizar el tejido.

Finalmente, transfiera las rodajas a una placa de varios pocillos que contenga medios. Las rodajas de pulmón preparadas con corte de precisión ahora están listas para experimentos.

Para comenzar este procedimiento, canule la tráquea insertando el tubo de silicona y fijándolo con una abrazadera paralela al tubo para que la pinza apriete el tejido junto al tubo de silicona sin pellizcarlo. Cierre todos los demás bronquios, vasos sanguíneos y lesiones con pinzas para que no se escape agarosa durante el procedimiento de llenado.

Se necesitan buenas habilidades anatómicas para canular el bronquio principal. Los pulmones no deben expandirse demasiado, de lo contrario, el tejido distraerá y, si el tejido no se llena lo suficiente, será imposible producir PCLS porque el tejido es demasiado blando.

Luego, mezcle un volumen equivalente de agarosa de baja gelificación al 3% con medio de cultivo en un vaso de precipitados e instile la mezcla en el pulmón con una jeringa de 50 mililitros. Antes de volver a llenar la jeringa con medio, cierre el catéter con los dedos o con una pinza para evitar burbujas de aire y fundente sin agarosa. Cortar el tejido pulmonar en losas de 3 a 5 centímetros.

Llene la cortadora de tejidos con 400 mililitros de EBSS helado. Inmediatamente, corte los núcleos de tejido cilíndricos de las losas pulmonares con un destornillador semiautomático con una herramienta de extracción de núcleos. Luego, transfiera los núcleos de tejido al soporte de tejido de la cortadora de tejidos. Coloque el peso sobre el núcleo de tejido y comience a cortar el núcleo de tejido en PCLS. El medio debe drenarse de la cortadora de tejidos en un vaso de precipitados abriendo la abrazadera del cilindro de vidrio.

A continuación, transfiera las rodajas de un vaso de precipitados a la placa de Petri con medio de cultivo. Después de eso, coloque la placa de Petri en una incubadora y deje que el medio se caliente antes de los pasos de lavado. Luego, transfiera las rodajas de pulmón con cuidado a una placa de cultivo de 24 pocillos con un mínimo de 500 microlitros de medio de cultivo para dos cortes por pocillo.