Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 2:58 min. • July 8th, 2025
Comience con cortes de pulmón humanos cortados con precisión, PCLS, tratados con agentes citotóxicos como moléculas de surfactante en una placa de múltiples pocillos.
El surfactante se inserta en la bicapa lipídica de la célula, lo que hace que las colas hidrofóbicas del surfactante interactúen con el núcleo hidrofóbico de la bicapa lipídica.
En consecuencia, se altera la disposición ordenada de las moléculas lipídicas, lo que lleva a la formación de una micela.
Esto compromete la integridad de la membrana, causando la fuga de contenido intracelular, incluida la lactato deshidrogenasa o LDH, un indicador común de daño en la membrana celular.
Recoge el sobrenadante que contiene la LDH liberada.
Agregue el cóctel de reacción del ensayo LDH que contiene sustrato de lactato, NAD+, diaforasa y sal de tetrazolio, e incube.
La LDH oxida el lactato a piruvato, con reducción simultánea de la coenzima NAD+ a NADH.
La diaforasa utiliza el NADH para reducir la sal de tetrazolio en formazán, un producto coloreado.
La citotoxicidad inducida por surfactante se puede medir a partir de la actividad de LDH indicada por la producción de formazán.
Después de incubar los PCLS con o sin agentes de prueba, transfiera 50 microlitros de sobrenadante y duplicados a una nueva placa de 96 pocillos. Esto genera duplicados de cada pocillo tratado de una placa de 24 pocillos.
Inmediatamente antes del ensayo, prepare una mezcla maestra de la solución de trabajo del reactivo LDH mezclando bien 125 microlitros de solución catalizadora con 6,25 mililitros de solución de tinte para una placa de 96 pocillos. Luego, pipetee 50 microlitros de la solución de trabajo de mezcla maestra en cada pocillo que ya contenga 50 microlitros de sobrenadante e incube la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, mida la absorción de cada pocillo a 492 nanómetros usando un lector de microplacas y reste la absorción a 630 nanómetros de referencia de la de 492 nanómetros.