Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:34 min. • July 8th, 2025
Tome un cubreobjetos con cámara que contenga mastocitos, células inmunitarias con gránulos secretores, o SG, que contienen mediadores inflamatorios.
Agregue anticuerpos IgE junto con un reportero fluorescente sensible al pH e incube.
Los anticuerpos se unen a los receptores Fc en los mastocitos. Los reporteros se internalizan a través de la pinocitosis y los endosomas resultantes se fusionan con los SG.
Retire el medio. Agregue un antígeno que contenga múltiples epítopos de unión a IgE; Coloque el portaobjetos bajo un microscopio de fluorescencia y aplique la longitud de onda de excitación requerida.
El pH ácido de los SG apaga la fluorescencia indicadora.
El antígeno se une a los complejos receptores de IgE en la superficie celular, entrecruzándolos.
La agregación de receptores mediada por antígenos hace que los SG migren hacia la membrana plasmática.
Las proteínas SNARE en el plasma y la membrana SG median la fusión de la membrana y la descarga de la carga SG, lo que se denomina exocitosis.
El pH más alto del medio provoca la alcalinización de SG, induciendo a los reporteros a recuperar la fluorescencia.
Los SG entrantes se fusionan con los fusionados con membrana. La alcalinización del segundo SG media la recuperación de la fluorescencia, confirmando la exocitosis compuesta.
Agregue 10 microlitros de la suspensión celular a un cubreobjetos con cámara con medios de cultivo nuevos suplementados con FITC-dextrano y cultive las células RBL durante la noche. Primero, prepare una solución tampón final de Tyrode de acuerdo con el protocolo de texto. Luego, prepare un reactivo secretagogo 20x en el tampón recién hecho.
Disuelva el polvo de cloruro de amonio en el tampón de Tyrode para crear una solución de cloruro de amonio de 400 milimolares. A continuación, aspire el medio del cubreobjetos con cámara y reemplácelo con 300 microlitros de tampón Tyrode precalentado. Después de repetir el proceso de lavado dos veces, reponga la cámara con 300 microlitros de tampón de Tyrode.
A continuación, coloque el cubreobjetos con cámara en la cámara de incubación de un microscopio y asegúrese de que la cámara sea estable. Encienda la fuente de luz fluorescente y seleccione el filtro de fluorescencia adecuado. Una vez que la región de interés esté enfocada en el medio del campo de visión, apague la fuente de luz.
Luego, encienda el láser de 488 nanómetros con la emisión recolectada alrededor de 500 a 550 nanómetros. A continuación, calibra el intervalo de tiempo entre las adquisiciones de imágenes. Establezca la dirección de escaneo en "Bidireccional". No permita promediar. Abra el orificio y establezca la resolución en 512 por 512.
A continuación, obtenga imágenes de las células durante la duración adecuada para el tipo de célula o secretagogo específico. Luego, agregue 16 microlitros de la solución secretagoga a la cámara y continúe filmando. Finalmente, para confirmar la presencia y localización de FITC-dextrano en los gránulos secretores, agregue suavemente 16 microlitros de solución de cloruro de amonio a la cámara.