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Inmunología
0 vistas • 2:49 min • July 8th, 2025
Tome un dispositivo de filtro centrífugo de gran volumen que contenga membranas de celulosa regeneradas verticales de un tamaño de poro adecuado.
Agregue tampón y centrifuge. Retire el humectante de membrana que contiene flujo continuo.
Cargue el dispositivo con proteína de filtrado de cultivo bacteriano, o CFP, que abarca proteínas solubles y vesículas extracelulares, o EV, estructuras unidas a lípidos de tamaño nanométrico que contienen biomoléculas secretadas por bacterias.
Durante la centrifugación, el CFP pasa tangencialmente a través de las membranas a través de la fuerza centrífuga.
Las biomoléculas más pequeñas que los poros de la membrana pasan a través del fluido de cultivo, mientras que las más grandes, como los vehículos eléctricos, pasan sobre la superficie de la membrana, minimizando la obstrucción de la membrana.
El filtro concentra el CFP en un volumen mínimo del dispositivo, ayudado por su volumen muerto para evitar que la biomolécula se seque.
Agregue tampón y centrifuge.
El tampón reemplaza los componentes residuales del medio, creando un entorno isotónico para las biomoléculas de CFP y manteniendo su integridad.
Coloque la taza de concentrado sobre la taza del filtro, invierta y centrifuge. Recupere el retenido de CFP concentrado para su posterior análisis.
Para comenzar, prepare un filtro centrífugo de corte de peso molecular de 100 kilodalton agregando la capacidad de volumen total de PBS. Centrifugar durante cinco minutos a 2.800 veces g a 4 grados centígrados. Deseche el flujo y cualquier PBS restante y llene la cámara de muestras con Mtb CFP hasta su máxima capacidad. Centrifugar a 2.800 veces g a 4 grados centígrados hasta que el volumen se haya reducido al volumen mínimo del dispositivo de ultrafiltración. Repita según sea necesario hasta que toda la muestra se haya reducido lo suficiente.
Agregue 1x PBS a la unidad de filtro que contiene el concentrado hasta la capacidad total del dispositivo. Reduzca el volumen como se describió anteriormente y repita este paso cinco veces para garantizar un lavado completo y el intercambio de tampón. Luego, recupere el retenido de CFP concentrado de 100 kilodalton, o 100R, de acuerdo con las especificaciones del dispositivo de ultrafiltración. Lave el filtro con un volumen mínimo de 1x PBS al menos tres veces y tire del lavado con el 100R para maximizar la recuperación.