JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 2:58 min • July 8th, 2025
Comience con larvas de pez cebra transgénicas que expresan células inmunitarias marcadas con fluorescencia marcadas con marcadores fluorescentes únicos para un seguimiento preciso.
Las larvas se inyectan previamente con proteína fluorescente roja que expresa esporas de Aspergillus, en su rombencéfalo.
Dentro del rombencéfalo, las esporas de hongos imitan la inflamación local y atraen células inmunes, incluidos los macrófagos, que fagocitan las esporas para su eliminación.
Mientras que algunas esporas persisten y germinan en hifas, liberando moléculas derivadas de patógenos y atrayendo neutrófilos al sitio de la infección.
Transfiera una larva anestesiada a la cámara de carga que contiene medio del dispositivo de herida y atrapamiento de pez cebra para crecimiento e imágenes, o zWEDGI, dispositivo interconectado a la cámara de herida a través de un canal de restricción.
Asegure la larva dentro del canal de restricción en una orientación dorsal-lateral para obtener imágenes del rombencéfalo.
En las primeras etapas, la fluorescencia roja representa las esporas de hongos, mientras que la fluorescencia verde confirma el reclutamiento de macrófagos en el sitio de la infección.
Con el tiempo, la propagación de la fluorescencia roja significa progresión de la infección, mientras que la aparición de fluorescencia azul adicional indica el reclutamiento de neutrófilos.
El día de la obtención de imágenes, prepare una placa de Petri de 3,5 milímetros con 100 PTU micromolares y otra con E3-tricaína. Agregue E3-tricaína en las cámaras de un dispositivo zWEDGI y use una micropipeta P100 para eliminar las burbujas de aire de las cámaras y el canal de restricción, luego, elimine todo el exceso de E3-tricaína fuera de las cámaras.
Pipetea una larva y transfiérela al plato con la PTU E3, luego, transfiérela a la E3-tricaína con la menor cantidad de líquido posible. Después de 30 segundos, transfiera las larvas anestesiadas a la cámara de carga del dispositivo de herida y atrapamiento.
Retire la E3-tricaína de la cámara de herida y suéltela en la cámara de carga para mover la cola de las larvas hacia el canal de restricción. Asegúrese de que la larva esté colocada en su lado lateral, dorsal o dorsolateral para que se pueda obtener una imagen del rombencéfalo con una lente de objetivo invertida.
Después de obtener imágenes de la larva con un microscopio confocal, libere E3-tricaína en la cámara de heridas para empujar la larva desde el canal de restricción hacia la cámara de carga. Recoja la larva y transfiérala de nuevo al plato con E3-tricaína, luego, transfiérala al plato con E3 PTU con la menor cantidad de líquido posible. Enjuáguelo en PTU y transfiéralo nuevamente a la placa de 48 pocillos.