Un ensayo de opsonoadherencia para evaluar la opsonización de bacterias encapsuladas por anticuerpos anticápsulas

Tome una suspensión de Bacillus anthracis químicamente muerto y marcado con fluorescencia.

La cápsula bacteriana, compuesta principalmente de ácido poli-gamma-glutámico, proporciona protección contra la fagocitosis.

Tome sueros de primates no humanos, inactivados por calor para destruir las proteínas del complemento. Estos sueros, aislados de animales inmunizados con una vacuna basada en cápsulas bacterianas, contienen anticuerpos anticápsulas.

Agregue la suspensión bacteriana químicamente muerta a los sueros. Los anticuerpos se unen específicamente a las cápsulas bacterianas, facilitando la opsonización bacteriana y marcándolas para su eliminación por las células fagocíticas. Agregue proteínas de complemento estándar para mejorar la opsonización.

Transfiera las bacterias opsonizadas a macrófagos adherentes: células fagocíticas. Incubar brevemente.

Los anticuerpos y las proteínas del complemento en las bacterias se unen a los receptores Fc y del complemento de los macrófagos, respectivamente, promoviendo la adherencia bacteriana.

Retire los medios. Lavar con tampón para eliminar las bacterias no adheridas.

Fije las células para preservar la integridad celular.

Use una tinción fluorescente para etiquetar los macrófagos.

Usando un microscopio de fluorescencia, observe las bacterias fluorescentes adheridas a macrófagos fluorescentes diferentes, confirmando la opsonización bacteriana efectiva por anticuerpos anticápsula.

Lave el caldo bacteriano inactivado tres veces en PBS para eliminar el fijador. Agregue la solución FITC a una concentración final de 75 microgramos por mililitro. Lentamente, agite la mezcla durante 18 a 24 horas a cuatro grados centígrados. Lave las bacterias como antes para eliminar el exceso de FITC.

Después del lavado final, vuelva a suspender los bacilos en PBS en el mismo volumen inicial. Alícuotas y guarde los bacilos a -20 grados centígrados hasta su uso. Inactivar con calor un pequeño volumen de sueros de prueba de primates no humanos a 56 grados Celsius durante 30 minutos, en un bloque de calor o en una máquina de PCR. Descongele y lave las bacterias marcadas con FITC con PBS dos veces mediante peletización a 15,000 veces g durante tres a cinco minutos. Vuelva a suspender en PBS en el mismo volumen de inicio.

En una placa de fondo redondo de 96 pocillos, diluya en serie los sueros de prueba en medio celular. En otra placa de fondo redondo de 96 pocillos, agregue 10 microlitros de sueros de prueba diluidos en cada pocillo. A continuación, añadir 10 microlitros de complemento de conejo bebé recién reconstituido.

A la placa número tres, agregue el volumen apropiado de bacilos marcados con FITC para una multiplicidad de infección de 20, por ejemplo, a un volumen que contenga 50,000 veces 20 bacilos para 50,000 células. Rellene cada pocillo en la placa número tres con el volumen apropiado de medio celular hasta un total de 105 microlitros. Incube la placa número tres a 37 grados Celsius durante 30 minutos en presencia de 5% de CO2 con humedad para opsonizar los bacilos.

Coloque la placa número uno que contiene células adherentes en un bloque de calor de 37 grados centígrados. Utilice una pipeta multicanal para eliminar el medio gastado de los pocillos y reemplácelo rápidamente con 100 microlitros de bacterias opsonizadas de la placa número tres, lo que garantiza que no se generen burbujas en los pocillos durante el pipeteo. Para no perturbar la monocapa celular, agregue volumen a los lados de los pocillos.

Incube la placa número uno a 37 grados centígrados con 5% de CO₂ y humedad durante 30 minutos para que se adhiera. Lave cada pocillo cinco veces con 150 microlitros de PBS sobre un bloque de calor de 37 grados Celsius para eliminar los bacilos sueltos. Pipetee al lado de los pocillos para asegurarse de que las células no se dispersen accidentalmente durante el lavado. Agregue 150 microlitros de paraformaldehído al 4% a cada pocillo y fije las células durante una hora.

Después de lavar las células dos veces con PBS, mezcle dos microlitros de tinción de células naranjas de detección de alto contenido en 10 mililitros de PBS. Luego, agregue 150 microlitros de esta solución de tinción a las células fijas e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Coloque la placa número uno en el escenario y concéntrese en las células utilizando el campo claro o el contraste de fase.

En la pestaña Adquisición, seleccione Formato de 96 pocillos como configuración de la placa y, a continuación, seleccione Configuración de canal. A continuación, seleccione Configuración en modo de mosaico. Indique el número de imágenes que se adquirirán. Cambie el modo de adquisición a blanco y negro o monocromo y establezca la agrupación en al menos 2 por 2. Encienda el enfoque automático o el módulo de enfoque. Indique la frecuencia con la que se debe realizar la función de enfoque automático.

A continuación, active la función de pila z si está disponible para indicar el número de pilas z que capturarán el grosor de la monocapa de la celda y los bacilos adherentes. Designe una carpeta de archivos para guardar las imágenes. Ahora, ejecute el programa de imágenes automatizado. Realizar la recopilación y el análisis de datos, como se describe en el protocolo de texto.