Evaluación de la activación controlada de células T con un péptido fotoactivable MHC

Comience recubriendo un cubreobjetos con poli-L-lisina biotinilada para crear una superficie rica en biotina.

A continuación, introduzca estreptavidina, una proteína que se une a la biotina, formando un puente molecular para las interacciones posteriores.

A continuación, agregue péptidos fotoenjaulados biotinilados unidos a los principales complejos de histocompatibilidad: pMHC junto con moléculas de adhesión.

Los ligandos pMHC biotinilados y las moléculas de adhesión interactúan con regiones específicas de la estreptavidina, lo que permite su inmovilización.

A continuación, lave el cubreobjetos con solución salina tamponada repetidamente e introduzca las células T.

La presencia de una fotojaula, un grupo químico sensible a la luz atado a un residuo específico en el péptido, obstruye la unión espontánea del receptor de células T al péptido.

Para una activación controlada de las células T, exponga los péptidos fotoenjaulados a la luz ultravioleta.

La luz ultravioleta rompe el enlace químico entre el complejo fotojaula-péptido, exponiendo la forma nativa del péptido.

Los receptores de células T identifican y se unen a los péptidos expuestos, mientras que las integrinas se unen a las moléculas de adhesión, desencadenando la activación de las células T.

Comience agregando poli-L-lisina biotinilada o bio-PLL diluida de 1 a 500 en agua desionizada destilada a 8 cubreobjetos de 8 pocillos. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, lavar con agua destilada desionizada y luego secar durante dos horas a temperatura ambiente.

Bloquee las superficies recubiertas de bio-PLL con un tampón de bloqueo que consiste en solución salina tamponada con HEPES con BSA al 2% durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, retire el tampón de bloqueo de las superficies recubiertas de bio-PLL sin permitir que los pocillos se sequen. Luego, agregue estreptavidina e incube a 4 grados centígrados.

Después de una hora, lave las superficies recubiertas con HBS. Llene e invierta los pocillos deslizantes de la cámara de 4 a 5 veces, eliminando HBS de los pocillos. No permita que los pozos se sequen.

Agregue los ligandos específicos del complejo de histocompatibilidad del péptido fotoactivable fotoactivado biotinilado y las moléculas de adhesión para células T CD4 positivas o células CD8 positivas a las superficies recubiertas de bio-PLL. Proteger de la luz e incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, lavar como antes y dejar en HBS hasta que esté listo para sembrar. Finalmente, agregue 200,000 células T CD4 positivas o CD8 positivas, expresando el TCR apropiado en los pocillos correctos, y deje que las células se adhieran a 37 grados Celsius durante 15 minutos.

Una vez que las células se han adherido y se han extendido por la superficie, están listas para la fotoactivación y la obtención de imágenes. Utilice un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total invertido equipado con una lente de objetivo de 150x compatible con UV para la adquisición de imágenes. Monitoree las sondas en los canales verde y rojo utilizando láseres de excitación de 488 nanómetros y 561 nanómetros, respectivamente.

Después de montar el portaobjetos de cámara que contiene las células T, ajuste la configuración del microscopio para obtener iluminación TIRF o epifluorescencia según sea necesario. En el modo en vivo, seleccione un campo de celdas que expresen las sondas fluorescentes de interés. Establezca regiones a escala micrométrica para la fotoactivación debajo de células individuales utilizando el control de software. Luego, comience la adquisición.

Normalmente, se adquieren 80 puntos de tiempo con un intervalo de 5 segundos entre cada uno. Esto deja tiempo para exposiciones secuenciales de 488 nanómetros y 563 nanómetros en el caso de experimentos de dos colores. Luego, después de adquirir 10 puntos de tiempo, fotoactive las regiones seleccionadas abriendo el obturador de diafragma digital durante 1 a 1,5 segundos. Una vez completado el lapso de tiempo, seleccione un nuevo campo de celdas y repita el proceso.