Un método de localización de inmunofluorescencia in vivo para estudiar la biodistribución de anticuerpos

Tomemos un modelo murino de cáncer de mama. Los tumores de la glándula mamaria comprenden células cancerosas, fibroblastos asociados al cáncer, adipocitos, células inmunitarias y vasculatura tumoral.

Inyecte por vía intravenosa anticuerpos específicos del tumor conjugados con fluoróforos.

Al llegar a la vasculatura tumoral, los anticuerpos se unen a las proteínas transmembrana específicas del tumor en el endotelio del vaso y las células cancerosas cercanas.

Aísle quirúrgicamente la glándula mamaria y sumérjala en un medio de congelación.

Obtenga criosecciones en un portaobjetos y enjuague con un tampón para eliminar el medio de congelación.

Fije las secciones para preservar la arquitectura del tejido. Aplique un detergente para mejorar la inmunotinción y una solución de bloqueo para evitar la unión de anticuerpos no específicos.

Introducir un anticuerpo primario específico para moléculas de adhesión en el endotelio de los vasos sanguíneos y un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo que se une al anticuerpo primario, marcando la vasculatura.

Agregue un medio de montaje en la corredera y coloque un cubreobjetos.

Bajo un microscopio confocal, evalúe la biodistribución de anticuerpos específicos del tumor dentro y alrededor de la vasculatura tumoral marcada con fluorescencia.

Después de la anestesia como se describe en el protocolo de texto, prepárese para la inoculación de la vena de la cola de las soluciones de anticuerpos. Desinfecte la cola del animal limpiando tres veces con una toallita con alcohol. Dilatar las venas de la cola calentando con una almohadilla térmica durante aproximadamente 30 segundos; Evite calentar todo el animal. Con un catéter de paleta de cola de calibre 27, inserte la aguja de mariposa en una de las dos venas laterales de la cola.

Visualice el reflujo de sangre en el catéter para asegurarse de que la aguja esté colocada correctamente para que las soluciones entren completamente en el animal en lugar de ser capturadas en la cola.

Use un trozo de cinta quirúrgica para fijar cuidadosamente la cola con la aguja insertada en el escenario. Enjuague el catéter con 25 microlitros de solución salina estéril tamponada con fosfato. Luego, inyecte la solución de anticuerpos en el catéter con jeringas de insulina. Enjuague el catéter una vez más con 25 microlitros de PBS estéril. Retire la aguja de la cola y aplique presión para detener cualquier sangrado.

Realice la eutanasia humana del ratón, como se describe en el protocolo de texto, y coloque al ratón en posición supina. Use tijeras quirúrgicas y fórceps para extirpar los tejidos tumorales. Use fórceps para agarrar solo la capa externa de piel entre el conjunto de glándulas mamarias más cercanas a la cola y para hacer una pequeña incisión con un par de tijeras quirúrgicas. Introduce las tijeras cerradas en el corte y abre lentamente la punta para separar con cuidado la piel de la membrana subyacente de la pared abdominal, manteniéndola intacta.

Haga una incisión vertical en el abdomen, continuando separando la piel de la membrana interna. Entre la tercera y cuarta glándulas mamarias, hacer un corte horizontal a través del abdomen, para permitir la retracción de la piel y la visualización de las glándulas mamarias. Agarrando cada tumor o glándula normal con fórceps, recorte cuidadosamente la piel adherida con unas tijeras quirúrgicas.

Coloque los pañuelos extirpados en moldes de base desechables de tejido que estén preetiquetados y llenos con un medio de inclusión a una temperatura de corte óptima. Congele rápidamente los moldes colocándolos sobre hielo seco. Para estudiar la administración fuera del objetivo, extirpe otros tejidos u órganos de interés. Con un criostato, seccione los bloques de tejido congelado con un grosor de 10 micras y coloque las secciones adyacentes en portaobjetos de vidrio de adhesión preetiquetados.

Enjuague los portaobjetos de tejido congelados con PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos para eliminar el medio de inclusión. Demarque las secciones de tejido con un lápiz de barrera hidrofóbica para reducir el volumen de soluciones necesarias durante la tinción. Fije las secciones de tejido con una solución de paraformaldehído al 4% durante 5 minutos. Después de enjuagar los portaobjetos en PBS durante 5 minutos, permeabilice las secciones de tejido con Triton X-100 al 0,5% en PBS durante 15 minutos. Enjuague los portaobjetos nuevamente en PBS durante 5 minutos.

Bloquee los tejidos con PBS que contengan albúmina sérica bovina al 3% en peso por volumen y suero caprino al 5% en volumen durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de enjuagar los portaobjetos en PBS durante 5 minutos, incube las secciones con anticuerpos primarios que mantengan registros, como un marcador nuclear, vascular o citoplasmático común. Aquí, el CD31 anti-ratón para ratas se usa en una dilución de 1 a 100 en la solución de bloqueo. Los portaobjetos con anticuerpos primarios se dejan durante la noche a 4 grados centígrados, protegidos de la deshidratación en una bandeja de portaobjetos.

Después de la incubación, enjuague los portaobjetos en PBS durante 5 minutos tres veces. Cambie el PBS cada vez. Incube los portaobjetos con anticuerpos secundarios para marcar los anticuerpos primarios. Para esta aplicación, visualice el anticuerpo anti-B7-H3 usando el anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado AlexaFluor-546 y visualice CD31 con el anticuerpo secundario anti-rata de cabra AlexaFluor-488 en solución de bloqueo. Proteja los portaobjetos de la luz y la deshidratación en una bandeja de portaobjetos durante 1 hora a temperatura ambiente.

Después de enjuagar los portaobjetos en PBS, como antes, aplique una gota del medio de montaje en el centro de la rebanada de tejido. Coloque con cuidado un cubreobjetos evitando que queden atrapadas las burbujas de aire. Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente y deje secar. Proceda con las imágenes de microscopía confocal y el análisis cuantitativo de imágenes, como se describe en el protocolo de texto.