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$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tome una mezcla de diferentes juegos de microesferas o perlas de poliestireno del tamaño de una micra.
Cada conjunto está acoplado a un antígeno único de un patógeno ambiental y está marcado de forma fluorescente de forma única.
Agregue la mezcla a una placa de filtro que contenga una membrana en la parte inferior.
Introducir saliva humana que contenga anticuerpos contra patógenos ambientales, que se unen a antígenos afines en las microesferas.
Eliminar los anticuerpos no unidos por vacío. Los anticuerpos unidos a microesferas se retienen debido al pequeño tamaño de poro de la membrana.
Agregue anticuerpos secundarios biotinilados para unirse a los anticuerpos unidos a microesferas. Eliminar los anticuerpos no unidos.
Agregue estreptavidina conjugada a un colorante indicador fluorescente, que se une a la biotina en los anticuerpos secundarios.
Retire el tinte no unido, vuelva a suspender las microesferas y páselas a través de un analizador de inmunoensayo multiplex.
Un rayo láser detecta la fluorescencia de la microesfera, identificando el antígeno, mientras que otro haz detecta la señal indicadora, confirmando un anticuerpo unido.
Los anticuerpos específicos de antígeno en la saliva indican una exposición previa a los patógenos correspondientes.
Después de resuspender las perlas acopladas al antígeno mediante vórtice y sonicación durante 20 segundos, diluya las perlas acopladas a una concentración final de 100 perlas por microlitro de cada perla única engastada en PBS más BSA. Luego, prepare una dilución de 1 a 4 de saliva a temperatura ambiente en PBS más BSA en una placa de pocillos profundos de 96 pocillos. Humedezca previamente una placa de filtro con 100 microlitros de tampón de lavado y aspire el sobrenadante.
A continuación, agregue 50 microlitros de perlas acopladas a antígenos y un volumen igual de saliva diluida a 95 pocillos de la placa de filtro de 96 pocillos para una dilución final de uno a ocho. Al mismo tiempo, agregue 50 microlitros de perlas acopladas a antígenos más 50 microlitros de PBS más BSA solo al pozo de control.
Incube las perlas en la oscuridad a temperatura ambiente durante una hora en el agitador de microplacas a 500 RPM. Luego, aspire el sobrenadante y lave los pocillos dos veces con 100 microlitros de tampón de lavado. Después del segundo lavado, vuelva a suspender las perlas en 50 microlitros de PBS más BSA, diluya el anticuerpo secundario y agregue 50 microlitros a cada pocillo.
Después de mezclar el contenido del pocillo con una pipeta multicanal, incube la placa en el agitador en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, lave los pocillos dos veces con 100 microlitros de tampón de lavado y vuelva a suspender las perlas en 50 microlitros de PBS fresco más BSA.
Ahora, diluya el reportero y agregue 50 microlitros a cada pocillo. Mezclar bien con la pipeta multicanal. Después de 30 minutos a temperatura ambiente en la coctelera en la oscuridad, lave los pocillos dos veces como se demostró. Luego, vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de PBS más BSA y evalúe las muestras en el analizador.