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Inmunología
0 vistas • 4:34 min • July 8th, 2025
Tome una placa de pocillos múltiples que contenga células de osteosarcoma adherentes en los cubreobjetos.
Estas células de cáncer de hueso se tratan previamente con un químico que induce estrés, lo que resulta en la formación de gránulos de estrés.
Los gránulos de estrés son orgánulos sin membrana citoplasmática que comprenden ARNm no traducibles, pequeñas subunidades ribosómicas, proteínas de unión al ARN o RBP, factores relacionados con la traducción y proteínas de señalización.
Deseche el medio y lave las celdas con tampón. Fije las células para preservar la morfología celular.
Permeabiliza las células para acceder a dianas intracelulares. Agregue proteínas bloqueadoras para evitar la unión de anticuerpos no específicos.
Introducir anticuerpos primarios que se unan a RBP específicos y factores relacionados con la traducción dentro de los gránulos de estrés.
Incubar con diferentes anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo y colorante Hoechst.
Los anticuerpos secundarios se unen a los anticuerpos primarios unidos a las proteínas asociadas a los gránulos de estrés, mientras que las moléculas de Hoechst tiñen el ADN.
Monte los cubreobjetos que contienen celdas utilizando medios de montaje.
Usando un microscopio de fluorescencia, observe las células para visualizar y cuantificar los gránulos de estrés, que aparecen como focos fluorescentes caracterizados por la colocalización de proteínas asociadas.
Para fijar las células, retire el medio de los pocillos y lave las células con aproximadamente 250 microlitros de PBS. Agregue aproximadamente 250 microlitros de una solución de paraformaldehído al 4% tamponada para fijar las células, asegurándose de que la parte superior del cubreobjetos esté completamente cubierta. Luego, deje el plato en un balancín a temperatura ambiente durante 15 minutos. A continuación, retire y deseche adecuadamente el paraformaldehído.
Agregue aproximadamente 250 microlitros de metanol helado para permeabilizar y aplanar las células. Incube la placa durante 5 minutos más a temperatura ambiente en un balancín. Una vez completada la permeabilización, deseche el metanol y bloquee las células aplicando aproximadamente 250 microlitros de un tampón de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, prepare la solución de anticuerpos primarios agregando 12 microlitros de los anticuerpos contra G3BP1, eIF4G y eIF3b a 3 mililitros de tampón de bloqueo.
Agregue 250 microlitros de la solución de anticuerpos a cada pocillo de la placa de 24 pocillos. Incube la placa en un balancín durante al menos 1 hora a temperatura ambiente. Después de 1 hora de incubación, retire la solución de anticuerpos y lave las células con aproximadamente 250 microlitros de PBS durante 5 minutos. A continuación, agregue 12 microlitros de anticuerpos anti-ratón Cy2, anti-conejo Cy3 y anti-cabra Cy5 junto con 3 microlitros de colorante Hoechst a 3 mililitros de tampón de bloqueo para preparar la solución de anticuerpos secundarios.
Agregue 250 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios a cada pocillo y cubra la placa para proteger las muestras de la luz. Incube la placa en un balancín a temperatura ambiente durante 1 hora. Cuando se complete la incubación, retire la solución de anticuerpos y lave las células con PBS durante 5 minutos. Caliente el medio de montaje en el bloque de calor de 37 grados Celsius durante 10 minutos para reducir la viscosidad. A continuación, con una punta de pipeta precortada de 200 microlitros, coloque 25 microlitros del medio de montaje en un portaobjetos de vidrio etiquetado.
Con pinzas finas, transfiera el cubreobjetos del pocillo al portaobjetos, invirtiendo la parte superior para que las células miren hacia el medio de montaje. Use una punta P200 limpia para presionar el cubreobjetos hacia abajo. Una vez montados todos los cubreobjetos, retire el exceso de medio de montaje presionando firmemente un pañuelo de papel de laboratorio contra el portaobjetos. Luego, enjuague el portaobjetos con agua e inmediatamente séquelo con tejido de laboratorio una vez más.