Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 2:55 min. • July 8th, 2025
Descongele los papeles de filtro que contienen el líquido absorbido del revestimiento de la mucosa nasal en hielo para evitar la degradación de la muestra.
El líquido comprende mediadores inmunológicos, incluidas quimiocinas y citocinas.
Sumerja los papeles de filtro en un tampón. Transfiera el contenido a filtros de tubo. Centrifugar para eluir el líquido de revestimiento de la mucosa del papel de filtro.
Agregue el extracto nasal filtrado a la placa de ensayo con un patrón de una variedad de anticuerpos de captura específicos del mediador.
Los mediadores inmunológicos se unen a sus anticuerpos correspondientes.
Introducir anticuerpos de detección marcados con un complejo de rutenio, que se unen a sus respectivos mediadores.
Agregue tampón basado en tris que contenga tripropilamina o TPA.
Cuando se aplica un potencial a través de los electrodos, el complejo de rutenio y el TPA se oxidan.
El radical TPA resultante excita el complejo de rutenio.
Al volver a su estado fundamental, el complejo de rutenio emite fotones.
La intensidad de la luz medida es proporcional a la concentración específica del mediador inmunitario en el líquido del revestimiento de la mucosa.
Para la cuantificación del mediador inmunitario de las vías respiratorias, coloque hasta 10 muestras de almacenamiento negativo a 80 grados Celsius en hielo y registre sus números de identificación. Cuando las muestras se hayan descongelado, sumerja ambos papeles de filtro por sujeto en 150 microlitros de tampón recién preparado por papel de filtro.
Complementarlo con una tableta completa de inhibidor de proteasa por cada 25 mililitros de solución madre tampón. Transfiera las muestras a un agitador de placas a 400 RPM durante 5 minutos. Transfiera el tampón y los papeles de filtro a los vasos de los filtros de tubo de acetato de celulosa individuales.
Centrifugar las muestras para recoger el extracto nasal filtrado en el fondo de los tubos de microcentrífuga. Luego, retire las tazas y coloque los tubos en hielo. A continuación, transfiera alícuotas de 150 microlitros del extracto nasal a pocillos individuales de placas de almacenamiento de baja unión a proteínas y almacene las placas a 80 grados Celsius negativos hasta el análisis. Luego, mida la concentración de los mediadores inmunológicos nasales de interés mediante una matriz multiplexada basada en electroquimioluminiscencia de alta sensibilidad, de acuerdo con los protocolos de ensayo estándar.