Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 2:42 min. • July 8th, 2025
Los virus envueltos con proteínas de pico transmembrana contienen un sitio de escisión proteolítica.
Las proteasas unidas a la membrana en las células huésped escinden las proteínas de pico, exponiendo péptidos de fusión que facilitan la entrada del virus.
Para comenzar, tome péptidos de tipo salvaje con el sitio de escisión canónico y péptidos variantes, cada uno con una mutación única en el sitio.
Los péptidos fluorogénicos contienen un fluoróforo y un extintor. Debido a la proximidad, el extintor absorbe la fluorescencia del fluoróforo.
Tome una placa de varios pocillos en hielo, que contenga tampón de ensayo y proteasas del huésped.
Agregue los péptidos de tipo salvaje y variante en pocillos separados. Incubar a una temperatura adecuada para una actividad óptima de la proteasa.
La proteasa escinde los péptidos, separando el extintor del fluoróforo y permitiendo su emisión de fluorescencia.
Mida el cambio en la señal de fluorescencia para determinar la tasa de escisión proteolítica.
Una tasa más alta para la secuencia de tipo salvaje indica una mayor actividad proteolítica, mientras que una tasa más baja para las variantes indica una eficiencia de escisión alterada.
Prepare los tampones de ensayo apropiados para las proteasas como se describe en el protocolo de texto y enfríe los tampones en hielo. Coloque una placa de 96 pocillos de fondo plano de poliestireno negro sólido sin tratar sobre hielo con una placa de metal delgada debajo para apoyar el enfriamiento y la estabilidad.
Es esencial utilizar una placa negra como placa de ensayo para evitar fugas fluorescentes de pozos adyacentes.
Por péptido, preparar tres réplicas técnicas por ensayo en un volumen total de 100 microlitros por muestra. Pipetee la cantidad adecuada de tampón de ensayo en cada pocillo de la placa de ensayo. Agregue 0,5 microlitros de proteasa a cada pocillo. A seis pocillos, agregue 0,5 microlitros de tampón en lugar de la proteasa respectiva. Tres de estos serán controles en blanco y los otros tres serán controles de péptidos.
Agregue 5 microlitros del péptido a una concentración final de 50 micromolares a cada pocillo, excepto los controles en blanco. A cada uno de los tres pocillos de control en blanco, agregue 5 microlitros de tampón en lugar de péptido. Inserte la placa en el lector de placas de fluorescencia y haga clic en Iniciar.