Un ensayo de escisión de péptidos fluorogénicos para detectar la actividad proteolítica de las proteasas
Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 2:42 min. • July 8th, 2025
Los virus envueltos con proteínas de pico transmembrana contienen un sitio de escisión proteolítica.
Las proteasas unidas a la membrana en las células huésped escinden las proteínas de pico, exponiendo péptidos de fusión que facilitan la entrada del virus.
Para comenzar, tome péptidos de tipo salvaje con el sitio de escisión canónico y péptidos variantes, cada uno con una mutación única en el sitio.
Los péptidos fluorogénicos contienen un fluoróforo y un extintor. Debido a la proximidad, el extintor absorbe la fluorescencia del fluoróforo.
Tome una placa de varios pocillos en hielo, que contenga tampón de ensayo y proteasas del huésped.
Agregue los péptidos de tipo salvaje y variante en pocillos separados. Incubar a una temperatura adecuada para una actividad óptima de la proteasa.
La proteasa escinde los péptidos, separando el extintor del fluoróforo y permitiendo su emisión de fluorescencia.
Mida el cambio en la señal de fluorescencia para determinar la tasa de escisión proteolítica.
Una tasa más alta para la secuencia de tipo salvaje indica una mayor actividad proteolítica, mientras que una tasa más baja para las variantes indica una eficiencia de escisión alterada.
Prepare los
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