Monitorización de la llegada de proteínas de superficie marcadas con GFP a la red Trans-Golgi utilizando nanocuerpos funcionalizados
Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 5:00 min. • July 8th, 2025
Comience con células cancerosas privadas de sulfato que expresan una proteína de superficie marcada con GFP.
Agregue sulfato radiomarcado y nanocuerpos anti-GFP modificados, un anticuerpo de cadena única que lleva un motivo de sulfatación de tirosina, e incube.
Las células privadas de sulfato internalizan los sulfatos radiomarcados, incorporándolos a los componentes celulares.
El nanocuerpo anti-GFP se une a la proteína de superficie marcada con GFP y se endocita en una vesícula. Esta vesícula transporta el complejo de proteínas de la superficie del nanocuerpo a lo largo de vías intracelulares específicas, incluida la red trans-Golgi o TGN.
Dentro del TGN, la sulfotransferasa en presencia de un sustrato transfiere un sulfato radiactivo a residuos específicos de tirosina en el nanocuerpo, marcándolo así con radiomarcado.
Lavar las células. A continuación, lisar las células.
Centrifugar el lisado para eliminar los restos celulares grandes. Aísle los nanocuerpos utilizando un método de purificación basado en perlas de níquel.
Cargue la fracción aislada en un gel SDS-PAGE para separar el nanocuerpo radiomarcado en bandas distintas.
Someter el gel a autorradiografía.
La autorradiografía
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