Un ensayo para cuantificar la fagocitosis mediada por anticuerpos de eritrocitos infectados por parásitos

Tome eritrocitos infectados con Plasmodium falciparum. Etiquete el ADN del parásito con un tinte fluorescente para la visualización del parásito.

Incube estos eritrocitos infectados por parásitos con sueros de individuos expuestos a la malaria. Estas células muestran antígenos de parásitos en su superficie, que se adhieren a los anticuerpos IgG humanos adquiridos naturalmente en sueros, opsonizando las células para la fagocitosis.

Transfiera los eritrocitos infectados con parásitos opsonizados a una placa de múltiples pocillos recubierta de proteínas que contiene una suspensión de monocitos derivados de humanos, o células fagocíticas.

Durante la incubación, los receptores Fc-gamma de los monocitos interactúan con los eritrocitos opsonizados con IgG, lo que desencadena la absorción de eritrocitos en fagosomas.

Después de la incubación, centrifugar la placa para evitar más interacciones celulares y detener la fagocitosis.

Deseche el sobrenadante. Tratar con solución lisante de cloruro de amonio, rompiendo selectivamente eritrocitos infectados no fagocitados sin afectar a los monocitos.

Agregue un tampón que contenga suero para detener el proceso de lisis. Centrifugar y desechar el sobrenadante que contiene eritrocitos lisados.

Vuelva a suspender los monocitos en un tampón.

Realice citometría de flujo para cuantificar los monocitos que muestran fluorescencia de los eritrocitos infectados por parásitos dentro de ellos, confirmando su fagocitosis mediada por anticuerpos.

Ajuste la suspensión de eritrocitos infectados purificados en 3,3 veces 10 a las 7 células por mililitro en un medio de cultivo de parásitos que contenga bromuro de etidio a una concentración final de 2,5 microgramos por mililitro. A continuación, retire la solución de bloqueo de una placa de 96 pocillos colocando la placa en un contenedor de residuos. Luego, retire cualquier exceso sobre una toalla de papel y agregue 30 microlitros de la suspensión de eritrocitos infectados con la etiqueta de bromuro de etidio en todos menos uno en la mitad superior de la placa. Agregue 30 microlitros de medio de cultivo de parásitos al pozo vacío e incube la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente, protegida de la luz.

Al final de la incubación, agregue 170 microlitros de medio de cultivo de parásitos a cada pocillo y sedimente los eritrocitos infectados en el fondo de la placa por centrifugación. Retire el sobrenadante colocando la placa en un contenedor de desechos y lave los eritrocitos infectados marcados con bromuro de etidio dos veces más con 200 microlitros de medio de cultivo de parásitos por pocillo, como se acaba de demostrar.

Después del segundo lavado, use una pipeta multicanal para eliminar cuidadosamente todo el volumen de sobrenadante de cada pocillo, sin alterar los gránulos, y vuelva a suspender los eritrocitos infectados marcados con bromuro de etidio en 30 microlitros de solución de anticuerpos, incluidos los controles apropiados y las muestras de prueba previamente preparadas en medio de cultivo de parásitos. Luego, coloque el plato a 37 grados centígrados durante 45 minutos, protegido de la luz.

Mientras se opsonizan los eritrocitos infectados, recolecte las células THP-1 por centrifugación y vuelva a suspender el sedimento en 12 mililitros de medio de cultivo celular THP-1 fresco precalentado.

Después de una segunda centrifugación, vuelva a suspender el sedimento en 1 mililitro de medio de cultivo celular THP-1 para el recuento y ajuste la concentración celular a 5 veces 10 a la 5ª célula por mililitro en medio de cultivo celular THP-1. Retire la solución de bloqueo de la segunda placa de 96 pocillos y agregue 100 microlitros de células THP-1 a cada pocillo. Luego, coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares.

Al final de la incubación de opsonización, agregue 170 microlitros de medio de cultivo de parásitos a cada pocillo de la placa de opsonización y sedimente los eritrocitos infectados en el fondo de la placa mediante centrifugación. Lave los eritrocitos infectados opsonizados dos veces con 200 microlitros de medio de cultivo de parásitos por pocillo utilizando una pipeta multicanal para eliminar cuidadosamente el sobrenadante después del segundo lavado.

Vuelva a suspender los eritrocitos infectados opsonizados en 100 microlitros de medio de cultivo celular THP-1 precalentado por pocillo y transfiera 50 microlitros de cada suspensión de eritrocitos infectados opsonizados a un pocillo correspondiente en la placa de fagocitosis. Cuando se hayan agregado todas las células, coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante no más de 40 minutos, protegida de la luz.

Al final de la incubación, detenga la fagocitosis por centrifugación a 4 grados centígrados. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos con 150 microlitros de solución de lisis de cloruro de amonio a temperatura ambiente por pocillo. Después de exactamente tres minutos, agregue 100 microlitros de FBS helado al 2% en PBS para detener la lisis y sedimentar las células intactas por centrifugación.

A continuación, lave las células tres veces con 200 microlitros de FBS fresco helado al 2% en PBS, por pocillo, por lavado. Después del lavado final, vuelva a suspender el sedimento celular en 200 microlitros de FBS fresco helado al 2% en PBS por pocillo.

Para la adquisición y el análisis de citometría de flujo, cargue inmediatamente las células en un citómetro de flujo y use el gráfico de dispersión lateral lineal hacia adelante versus lineal para los pocillos sin eritrocitos infectados para bloquear las células THP-1. Adquiera 10,000 eventos en esta puerta y use las células THP-1 con los eritrocitos infectados opsonizados con un control positivo para configurar un gráfico de histograma para medir la intensidad de fluorescencia del bromuro de etidio.

Para el análisis, abra el gráfico lineal de dispersión lateral hacia adelante versus lineal para los pocillos sin eritrocitos infectados y coloque las células THP-1. Luego, configure una puerta positiva en un histograma FL3 y copie estas puertas en todos los demás pocillos de muestra para determinar el porcentaje de células THP-1 positivas para bromuro de etidio.