Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 2:59 min. • July 8th, 2025
Tome una microplaca que contenga serina proteasas de neutrófilos o NSP. Estas enzimas solubles con actividad proteolítica, secretadas por los neutrófilos, funcionan en las respuestas inflamatorias.
Agregue sondas reporteras fluorescentes con un motivo de reconocimiento que actúa como un sitio de escisión para los NSP. Las sondas se conjugan con un fluoróforo donante y aceptor.
Tras la excitación por una longitud de onda específica, el fluoróforo donante emite energía. Debido a su proximidad al donante, el fluoróforo aceptor absorbe la energía y emite fluorescencia de una longitud de onda diferente.
Detecte las señales de donante y aceptor por separado y calcule la relación donante-aceptor para evaluar la actividad de NSP. Una proporción baja indica enfriamiento de la fluorescencia del donante en ausencia de escisión de la sonda.
Los NSP reconocen y escinden el motivo de reconocimiento en las sondas, liberando el aceptor.
La distancia desde el aceptor permite la emisión de fluorescencia desde el fluoróforo donante, lo que aumenta la relación donante-aceptor. Una relación alta indica una escisión eficiente de la sonda por parte de los NSP.
Descongele las enzimas en hielo y establezca una curva estándar de enzimas como se describe en el manuscrito del texto. Paralelamente a la preparación estándar, diluya las muestras de esputo en tampón de activación. En el lector de placas, ajuste la longitud de onda de excitación de la sonda NE FRET NEmo-1 a 354 nanómetros y la longitud de onda de emisión a 400 nanómetros para el donante y 490 nanómetros para el aceptor.
Para la sonda CG FRET sSAM, establezca la longitud de onda de excitación en 405 nanómetros y la emisión en 485 nanómetros para el donante y 580 nanómetros para el aceptor. Agregue 40 microlitros de muestras, estándares o espacios en blanco en los pocillos de una placa negra de media área de 96 pocillos y agregue la mezcla maestra.
Encienda el lector de placas y registre el aumento de la relación donante-aceptor después de cada 60 a 90 segundos durante al menos 20 minutos o hasta que el aumento de la señal alcance una meseta. Exporte los datos y calcule la proporción donante-aceptor dividiendo la RFU del donante por la RFU del aceptor para cada punto de tiempo y muestra. Luego, calcule la media y la desviación estándar de la relación donante-aceptor. Determine la pendiente dentro del crecimiento lineal del cambio de la relación donante-aceptor.