Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 2:59 min. • July 8th, 2025
Tome una microplaca que contenga serina proteasas de neutrófilos o NSP. Estas enzimas solubles con actividad proteolítica, secretadas por los neutrófilos, funcionan en las respuestas inflamatorias.
Agregue sondas reporteras fluorescentes con un motivo de reconocimiento que actúa como un sitio de escisión para los NSP. Las sondas se conjugan con un fluoróforo donante y aceptor.
Tras la excitación por una longitud de onda específica, el fluoróforo donante emite energía. Debido a su proximidad al donante, el fluoróforo aceptor absorbe la energía y emite fluorescencia de una longitud de onda diferente.
Detecte las señales de donante y aceptor por separado y calcule la relación donante-aceptor para evaluar la actividad de NSP. Una proporción baja indica enfriamiento de la fluorescencia del donante en ausencia de escisión de la sonda.
Los NSP reconocen y escinden el motivo de reconocimiento en las sondas, liberando el aceptor.
La distancia desde el aceptor permite la emisión de fluorescencia desde el fluoróforo donante, lo que aumenta la relación donante-aceptor. Una relación alta indica una escisión eficiente de la sonda por parte de los NSP.
Descongele las enzimas en hielo y establezca
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