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A una muestra de sangre completa, agregue complejos de anticuerpos específicos dirigidos contra las células sanguíneas, excepto los neutrófilos.
Agregue partículas magnéticas que se unan a las células sanguíneas unidas al complejo de anticuerpos.
Transfiera la muestra etiquetada inmunomagnéticamente al puerto de carga celular de un chip microfluídico.
Conecte discos magnéticos al puerto de carga de celdas.
El campo magnético atrae las células etiquetadas inmunomagnéticamente, atrapándolas en las paredes laterales del puerto.
Los neutrófilos, al no estar etiquetados, fluyen hacia el chip y quedan atrapados en el área de acoplamiento celular.
Agregue una solución quimioatrayente marcada con fluorescencia y un medio de migración a los reservorios designados. Los líquidos fluyen a través de los canales microfluídicos, formando un gradiente de concentración.
Cuando el quimioatrayente se une al receptor de neutrófilos, desencadena cambios intracelulares, lo que hace que los neutrófilos reorganicen su citoesqueleto y extiendan los pseudópodos.
Estos pseudópodos actúan como pies, impulsando a los neutrófilos hacia concentraciones más altas de quimioatrayentes, un proceso llamado quimiotaxis.
Usar técnicas de microscopía apropiadas para monitorear la migración de neutrófilos en respuesta al gradiente quimioatrayente.
Retire el agua desionizada del dispositivo y agregue 100 microlitros de solución de fibronectina de la salida. Espere tres minutos para asegurarse de que todos los canales estén llenos de solución de fibronectina. Luego, incube el dispositivo en una placa de Petri tapada durante una hora a temperatura ambiente.
A continuación, retire la solución de fibronectina del dispositivo y agregue 100 microlitros de medio de migración de la salida. Nuevamente, espere tres minutos para asegurarse de que todos los canales estén llenos con el medio de migración. Incube el dispositivo durante otra hora a temperatura ambiente, antes de usarlo en el experimento de quimiotaxia. Coloque 10 microlitros de sangre completa en un tubo de 1,5 mililitros. Luego, agregue 2 microlitros del cóctel de anticuerpos en dos microlitros de partículas magnéticas de un kit de aislamiento de neutrófilos y mezcle suavemente el tubo para etiquetar magnéticamente las células marcadas con anticuerpos. Incube la mezcla de etiquetas durante cinco minutos a temperatura ambiente.
A continuación, conecte dos pequeños discos magnéticos a los dos lados del puerto de carga de celdas del dispositivo. Aspira el medio desde todos los puertos del dispositivo. Luego, pipetea lentamente dos microlitros de la mezcla de sangre marcada en el dispositivo microfluídico desde el puerto de carga celular. Coloque el dispositivo microfluídico en la platina del microscopio con temperatura controlada a 37 grados centígrados. Espere unos minutos hasta que queden suficientes neutrófilos atrapados en el área de acoplamiento celular.
A continuación, agregue 100 microlitros de la solución quimioatrayente en un medio de migración de 100 microlitros a sus depósitos de entrada designados, utilizando dos pipetas. Esto generará un gradiente quimioatrayente mediante una mezcla química continua basada en el flujo laminar. El quimioatrayente pueden ser proteínas recombinantes, como FMLP, o muestras clínicas, como el sobrenadante del esputo de pacientes con EPOC.
Una vez que el flujo se haya estabilizado, adquiera imágenes de fluorescencia del gradiente de dextrano FITC en el canal. Luego, incube el dispositivo en la platina de microscopio con temperatura controlada o en una incubadora de cultivo celular convencional durante 15 minutos. Después de la incubación, obtenga imágenes del canal de gradiente, utilizando un objetivo de 10 veces para registrar las posiciones finales de la célula para el análisis de datos.