Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 5:04 min. • July 8th, 2025
Tomemos dos poblaciones de células T CD8+: células T CD8+ efectoras preactivadas a través de la participación mediada por anticuerpos de las células T y los receptores coestimuladores y células T CD8+ suprimidas inhibidas por células supresoras derivadas de mieloides.
Agregue estas células T a pocillos recubiertos de membrana basal con células cancerosas que expresan una proteína fluorescente restringida nuclearmente.
Pipetear un sustrato fluorogénico de caspasa-3, un colorante fluorogénico que se une al ADN conjugado con un péptido que contiene el sitio de reconocimiento de la caspasa-3.
incubar. Los receptores de células T efectoras se unen al complejo MHC-péptido de clase I en las células cancerosas, lo que desencadena la liberación de gránulos citotóxicos que contienen perforinas y granzimas.
Las perforinas crean poros en la membrana de las células cancerosas, lo que permite la entrada de granzima y la activación de caspasas, iniciando la apoptosis.
Las caspasas activadas también escinden el sustrato de caspasas fluorogénicas, liberando el tinte que se une al ADN y emite fluorescencia.
Bajo un microscopio de fluorescencia, las células cancerosas cocultivadas con células T efectoras exhiben fluorescencia nuclear dual, lo que indica apoptosis de células cancerosas.
Por el contrario, las células cancerosas cocultivadas con células T suprimidas muestran solo fluorescencia de proteínas nucleares, lo que sugiere células no apoptóticas.
Para configurar un cocultivo de células diana de células T CD8 positivas preactivadas, primero, agregue 30 microlitros de 1 a 100 matriz de membrana basal soluble reducida en factor de crecimiento diluido a los pocillos apropiados de una placa de fondo plano de 96 pocillos adecuada para microscopía. Agite la placa para esparcir la matriz de manera uniforme y colóquela en la incubadora de cultivo celular durante al menos una hora. Mientras la placa se equilibra, prepare las células objetivo. Aspire el medio, lave con PBS y agregue 1 mililitro de tripsina-EDTA al 0,05% a temperatura ambiente durante 1 minuto.
Agregue 9 mililitros de DMEM suplementado con suero fetal bovino mediante un pipeteo suave y transfiera las células disociadas a tubos. Después de centrifugar las células, vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de EDMEM. Filtre las células resuspendidas a través de un filtro celular y cuente las células vivas. Luego, ajuste la densidad a 4 veces 10 a la cuarta célula diana por mililitro en EDMEM fresco con hielo.
A continuación, pipetee las células T CD8 positivas preactivadas varias veces para volver a suspender las células en una suspensión unicelular y transfiera las células T flotantes a un tubo de 1,5 mililitros por condición. Recoja las células restantes con 200 microlitros de PBS por pocillo, transfiera los lavados a los tubos apropiados de 1,5 mililitros y centrifuge. Aspire el medio y agregue 1 mililitro de EDMEM a cada tubo para centrifugar.
Después de la centrifugación, vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de EDMEM fresco por tubo. Después de contar, ajuste las células de cada tubo a una densidad de 1,6 por 10 a la quinta célula T CD8 positiva preactivada por mililitro de medio, y coloque las células en hielo. Cuando las células estén listas, aspire la matriz de la membrana basal de cada pocillo de la placa de microscopía de 96 pocillos y agregue 50 microlitros de células diana a los pocillos individuales dentro de los 60 pocillos internos de la placa con la mezcla.
Agregue 25 microlitros de EDMEM suplementados con 4 veces 10 a las terceras unidades por mililitro de IL-2, y 10 sustratos micromolares de caspasa-3 fluorogénica a los pocillos apropiados. Luego, agregue 25 microlitros de células T CD8 positivas preactivadas a los pocillos apropiados y, finalmente, agregue EDMEM a los pocillos apropiados para obtener un volumen total de hasta 100 microlitros. Agregue 200 microlitros de PBS o agua estéril en todos los pocillos vacíos, agite la placa y déjela sobre una superficie plana durante 10 minutos.
Para obtener imágenes de las células, configure el microscopio para adquirir imágenes en contraste de fase, así como canales fluorescentes adecuados para la proteína fluorescente restringida nuclearmente y los fluoróforos de sustrato de caspasa-3 activados fluorogénicos utilizados en el experimento. Luego, capture imágenes de cada pozo experimental en contraste de fase y los dos canales fluorescentes cada una a tres horas durante al menos 72 horas.