Un ensayo multiplexado basado en perlas para analizar citocinas en muestras de lágrimas humanas

Agregue muestras de lágrimas humanas y un cóctel de perlas de anticuerpos en una placa de ensayo lavada.

Los anticuerpos se unen a perlas magnéticas codificadas por colores, impregnadas con proporciones variables de fluoróforos correspondientes a distintas firmas espectrales, lo que facilita la detección de múltiples citoquinas.

Las citocinas lagrimales se unen a sus correspondientes anticuerpos de captura unidos a perlas.

Usando una lavadora de placas magnéticas, asiente los complejos de anticuerpos-perlas. Con tampón, retire las biomoléculas no unidas.

Agregue anticuerpos de detección biotinilados que se adhieran a las citocinas unidas.

Conjugado de pipeta estreptavidina-ficoeritrina, que se une a los anticuerpos biotinilados.

Con la lavadora de placas, retire el contenido del pocillo no unido. Vuelva a suspender los complejos unidos a citocinas en el líquido de la vaina.

Durante el análisis de muestras, el sistema fluídico transporta los complejos de perlas al conjunto óptico.

El primer láser activa los colorantes internos de las perlas, y la señal resultante identifica citocinas específicas.

El segundo láser activa la molécula reportera unida al complejo de perlas, cuya intensidad de señal representa la concentración de citoquinas, lo que permite la cuantificación simultánea de múltiples citocinas.

Para llevar a cabo el ensayo multiplex basado en perlas, lleve todos los reactivos a temperatura ambiente y vórtice durante cinco a 10 segundos. Si las muestras de lágrimas eluidas se almacenaron a menos 80 grados Celsius antes del ensayo, descongele los extractos de lágrimas congelados en hielo y centrifugue las muestras a 1.000 veces g durante cinco minutos. Prepare una hoja de trabajo de ensayo en una configuración vertical para trabajar con los estándares de citocinas humanas QC-1, QC-2 y muestras.

Agregue 200 microlitros de 1x tampón de lavado a cada pocillo de la placa y séllelo con un sellador de placas. Luego, incube el plato en un agitador de platos a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, decanta el tampón de lavado 1x invirtiendo la placa y golpéalo sobre toallas absorbentes varias veces para eliminar cualquier cantidad residual de tampón de lavado en los pocillos.

Luego, agregue 25 microlitros de cada estándar de citoquinas humanas que funcione QC-1, QC-2 y el blanco con solo tampón de ensayo y muestras en los pocillos apropiados. Agregue 25 microlitros de tampón de ensayo en cada pocillo. Luego, a los pocillos, agregue 25 microlitros de 1x solución de cóctel de perlas de anticuerpos.

Como la solución de perlas de anticuerpos es sensible a la luz, selle la placa y cúbrala con papel de aluminio y una cubierta de placa para protegerla de la luz durante el ensayo. Incube el plato a cuatro grados centígrados en una coctelera durante la noche. Al día siguiente, coloque la placa en el estante de placas de una lavadora de placas magnética automática y déjela reposar durante un minuto para asentar las perlas magnéticas en el fondo del pozo.

Aspire el contenido del pocillo y agregue 200 microlitros de tampón de lavado por pocillo con una lavadora automática de placas magnéticas. Deje reposar el plato durante un minuto, y luego, aspire el contenido del pozo como antes y repita el lavado una vez más. Agregue 25 microlitros de solución de anticuerpos de detección en cada pocillo. Selle el plato, cúbralo con papel de aluminio y tapa del plato, e incube a temperatura ambiente en una coctelera durante 60 minutos. Luego, agregue 25 microlitros de solución de estreptavidina-ficoeritrina en cada pocillo y, después de sellar y cubrir la placa, incube a temperatura ambiente en un agitador durante 30 minutos.

Después de la incubación, coloque la placa en una lavadora magnética y déjela reposar durante un minuto. Luego, aspire el contenido del pocillo y agregue 200 microlitros de tampón de lavado por pocillo. Déjelo reposar durante un minuto, luego, aspire el contenido del pocillo antes de repetir el lavado una vez más. Agregue 150 microlitros de líquido de vaina a cada pocillo. Luego, coloque la placa en un agitador durante cinco minutos a temperatura ambiente para volver a suspender las perlas de anticuerpos antes de proceder a leer la placa y analizar las concentraciones de citoquinas.