Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:42 min. • July 8th, 2025
Tome una microplaca que contenga segmentos de vaina uniformes cortados de plántulas de arroz y discos de hojas obtenidos de hojas de plantas de arroz.
Agregue agua estéril e incube durante la noche para permitir la recuperación del estrés de la herida.
Agregue un péptido inmunogénico derivado de flagelos bacterianos que actúe como un patrón molecular asociado a patógenos o PAMP.
Las células vegetales en los bordes cortados se unen a los PAMP a través de receptores de reconocimiento de patrones.
La unión desencadena la señalización aguas abajo, activando una enzima localizada en la membrana plasmática denominada homóloga de oxidasa respiratoria o RBOH.
El RBOH activado produce especies reactivas de oxígeno o ROS en el apoplasto, el espacio intercelular. El ROS producido se convierte en peróxido de hidrógeno.
Agregue una enzima peroxidasa y un sustrato quimioluminiscente.
La peroxidasa utiliza peróxido de hidrógeno para convertir el sustrato en un intermedio de estado excitado, que libera energía en forma de luz y vuelve al estado fundamental.
Mida la luminiscencia en ambos tipos de tejido para detectar un aumento brusco inmediatamente después del tratamiento con PAMP, lo que indica una ráfaga de ROS.
Corte la vaina de las plántulas de arroz de 10 días en segmentos de 3 milímetros con una cuchilla de afeitar afilada o una cuchilla quirúrgica para el pretratamiento un día antes del ensayo ROS. Coloque 5 segmentos de vaina en un pocillo individual de una placa de microtitulación de 96 pocillos que contenga 100 microlitros de agua doblemente destilada durante 10 a 12 horas.
Corte los discos de hojas de plantas de arroz de cuatro a seis semanas con un punzón de biopsia con un émbolo. Siempre corte los discos de hojas del tercio medio de la segunda hoja del timón principal para reducir la variación de datos. A continuación, coloque un disco de hoja en un pocillo individual de una placa de microtitulación de 96 pocillos que contenga 100 microlitros de agua doblemente destilada durante 10 a 12 horas para el pretratamiento. Mantenga todos los discos de las hojas flotando y mirando hacia arriba en los pocillos de una placa de microtitulación para el pretratamiento del agua para evitar la variación asociada al lado de la hoja.
Prepare la solución de elicitación combinando 9,4 ml de 50 tris-HCl micromolar, 400 microlitros de solución L-012, 100 microlitros de peroxidasa de rábano picante y 100 microlitros de flg22. Agregue 200 microlitros de solución de elicitación a los pocillos.
Inicie el software y haga clic en el botón Experimentos para crear un nuevo protocolo o usar un protocolo existente. Haga clic en Procedimiento en la ventana emergente para configurar la placa y seleccionar los pocillos de la placa que se van a monitorear. Haga clic en Iniciar cinética y establezca el tiempo de ejecución en 30 minutos o más, según los requisitos experimentales. Seleccione el intervalo mínimo para obtener las lecturas con la mayor frecuencia posible, y para el tiempo de integración, elija 1 segundo o más, dependiendo de la intensidad de la señal.
Haga clic en Validar seguido de Aceptar para confirmar la configuración. A continuación, haga clic en Detectar una nueva placa en la ventana emergente y espere a que el software le muestre el cuadro de diálogo de la placa de carga. Retire con cuidado el agua de doble destilación de los pocillos que contienen los tejidos pretratados, evitando cualquier daño tisular o desecación. Utilice una pipeta multicanal para agregar 200 microlitros de la solución de elicitación a los pocillos que contienen los tejidos. Coloque la placa a probar en el portador y comience la detección.