Medición de la aloreactividad en una población mixta de células T

Comience con una placa de pocillos múltiples que contenga células dendríticas de ratón, o CD portadoras de aloantígenos o variantes genéticas de autoantígenos.

Introducir células T de ratón, incluidas las células T aloreactivas que no reaccionan a los autoantígenos, mientras reconoce antígenos extraños.

Las células T aloreactivas reconocen estos aloantígenos e interactúan con las DC, desencadenando un reordenamiento del citoesqueleto, incluida la reorganización de la F-actina.

Esto promueve que los receptores de las células T se involucren con moléculas coestimuladoras en las DC, formando una conexión celular: una sinapsis inmunológica.

Fije las células, transfiéralas a un tubo e introduzca un cóctel de anticuerpos marcados con fluorocromo específicos para los receptores de células T y DC, impartiendo una fluorescencia distinta.

Elimine los anticuerpos no unidos y vuelva a suspender las células en un tampón que contenga un agente permeabilizante que permeabiliza las células y marcadores de proteínas marcados con fluoróforos verdes que se unen a la F-actina.

Centrifugar y volver a suspender las células en un tampón que contenga colorante nuclear, tiñendo los núcleos de rojo.

Usando citometría de flujo de imágenes, identifique los dobletes, correspondientes a los conjugados de células T y DC con retículas verdes de F-actina, lo que confirma la formación de sinapsis.

Cuantifique los dobletes que representan el grado de aloreactividad.

Comience sembrando 0,5 veces 10 a la sexta células dendríticas en cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos, seguido de 1 por 10 a la sexta célula T en un volumen final de hasta 50 microlitros totales de medio de cultivo por pocillo. Incubar los cultivos fríos durante cuatro horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Luego, agregue tres veces el volumen de cultivo de formaldehído al 1.5% en PBS a cada pocillo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Al final de la fijación, transfiera las células de cada pocillo a un tubo de poliestireno de 5 mililitros correspondiente y tiñe las células con los anticuerpos conjugados con fluorocromo apropiados en 100 microlitros de tampón de lavado durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz.

A continuación, lave las células en 1 mililitro de tampón de lavado y vuelva a suspender los gránulos en un tampón de lavado permanente que contenga faloidina-FITC. Después de otros 30 minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz, lave las células en 1 mililitro de tampón de lavado permanente fresco. Vuelva a suspender los gránulos en el tinte nuclear de interés en el tampón de lavado permanente para una incubación final de 30 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz, y lave las células en 1 mililitro de tampón de lavado permanente, seguido de un lavado solo en el tampón de lavado. Luego, vuelva a suspender las células en 50 a 100 microlitros de tampón de lavado fresco y transfiera las células a tubos de microcentrífuga de tapa pequeña.

Para analizar las interacciones de célula a célula, primero, reserve un canal para la adquisición de imágenes de campo claro y cargue el primer tubo de control. Con el canal de campo claro desactivado, en la ventana Espacio de trabajo, cree un nuevo gráfico de dispersión para cada canal utilizado con la relación de aspecto en el área y coloque los singlets donde la relación de aspecto sea cercana a uno.

Para cada fluorocromo, verifique la población positiva y ajuste el voltaje del láser en el cuadro de iluminación según sea necesario. En el cuadro Canales, seleccione los canales apropiados para los fluorocromos utilizados en la tinción. A continuación, haga clic en Grabar. Cuando el número de eventos alcanza el umbral especificado, la adquisición se detendrá automáticamente.

Una vez que se hayan adquirido todos los controles de tinción única, cargue el primer tubo de muestra experimental y adquiera varias decenas de miles de eventos en los canales de análisis apropiados, incluido el canal de campo claro.