JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
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Comience con una placa de pocillos múltiples que contenga líquido de lavado broncoalveolar de ratón que comprenda una población de células inmunitarias teñida con un colorante de viabilidad fluorescente verde.
Introducir anticuerpos Fc para bloquear los receptores Fc de las células inmunitarias.
Agregue un cóctel de distintos anticuerpos marcados con fluoróforo dirigidos a marcadores celulares específicos. Elimine los anticuerpos no unidos y vuelva a suspender las células en un tampón.
Usando citometría de flujo, identifique singletes de fluorescencia tenue, indicando células vivas.
Ilumina las células a 488 nanómetros, lo que hace que las células emitan fluorescencia roja correlacionada con las células que expresan CD11c.
Dentro de la población alta de CD11c, con filtros de longitud de onda apropiados, identifique las proteínas marcadoras celulares MHC-II en células dendríticas y SiglecF en macrófagos.
En la población baja de CD11c, la expresión de CD3 en las células T y CD19 en las células B permite su identificación.
Ilumina las células a 405 nanómetros, emitiendo fluorescencia azul, lo que significa que los neutrófilos que expresan CD11b.
La iluminación de células a 633 nanómetros excita fluoróforos de color rojo lejano en eosinófilos que expresan Ly-6G.
Usando datos de citometría de flujo, enumere la abundancia de cada tipo de célula inmune en el líquido de lavado broncoalveolar.
Después de la tercera recolección de lavado broncoalveolar, centrifugar el aspirado acumulado y almacenar el sobrenadante a 80 grados Celsius negativos. Vuelva a suspender el gránulo en 200 microlitros de tampón de lisis ACK. Después de no más de dos minutos a temperatura ambiente, diluya el tampón de lisis con un mililitro de PBS frío y recoja las células por centrifugación.
Vuelva a suspender el sedimento en el volumen apropiado de PBS para el número de muestras que se analizarán y alícuotas las células en el número apropiado de pocillos de una placa de 96 pocillos para el análisis. Recoger las células mediante otra centrifugación, y volver a suspender los pellets en 50 microlitros de bloque de FC en PBS.
Después de 10 minutos a temperatura ambiente, agregue 50 microlitros del cóctel de anticuerpos apropiado de interés a cada pocillo e incube las células durante 30 minutos a cuatro grados centígrados protegidas de la luz. Al final de la incubación, centrifugar la placa y desechar el sobrenadante, resuspendiendo los gránulos a un volumen final de 200 microlitros de tampón FACS por pocillo para el análisis de citometría de flujo.