JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 6:08 min • July 8th, 2025
Tome una placa de pocillos múltiples que contenga micobacterias. Agregue concentraciones crecientes de compuestos de prueba a los pocillos.
incubar. Dependiendo de la acción del compuesto sobre las micobacterias, puede inhibir el crecimiento de micobacterias, mostrando una actividad bacteriostática, o eliminar las micobacterias, demostrando actividad bactericida.
Transfiera las alícuotas de pozo a un ensayo de resazurina de agar de carbón, o CARA, microplaca que contenga agar con carbón activado para absorber el compuesto de prueba, evitando efectos de arrastre.
incubar. La actividad bacteriostática del compuesto inhibe la replicación de las micobacterias, mientras que la actividad bactericida reduce la viabilidad de las micobacterias.
Agregue tampón, resazurina y un surfactante no iónico para dispersar la resazurina en los pocillos.
En las micobacterias metabólicamente activas, las deshidrogenasas reducen la resazurina de color azul y débilmente fluorescente a una resourina fluorescente rosa.
Con un lector de microplacas, mida la fluorescencia de la resorufina en los pocillos.
Los pocillos que carecen de fluorescencia de resorofina indican la actividad bactericida del compuesto.
La intensidad variable de fluorescencia en los pocillos indica la carga bacteriana viva, lo que refleja la potencia bactericida o bacteriostática dependiente de la concentración de los compuestos de prueba.
Inocular tubos de centrífuga cónicos o de polipropileno de fondo redondo que contengan 4 o 20 mililitros respectivamente de Middlebrook 7H9-ADN, o 7H9-OADC con M. smegmatis a un DE580 de 0,01 a 0,1. Incubar los cultivos de M. smegmatis a 37 grados Celsius y 20% de O2 con agitación, expandiendo los cultivos a la fase logarítmica media o un DO aproximado de580 de 0.5.
Para establecer un experimento de estilo de concentración inhibitoria mínima en condiciones replicantes y no replicantes, distribuya 200 microlitros de células en 7H9-ADN a un OD580 de 0,01 en todos los pocillos de una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejidos de fondo transparente.
Para el ensayo no replicante, use PBS que contenga tilloxapol al 0,02% para lavar las células dos veces y use medio no replicante para resuspender las células. Use un medio no replicante para diluir las células a un OD580 de 0.1 y agregue nitrito de sodio a una concentración final de 0.5 a 5 milimolares de un caldo de 1 molar recién preparado.
Distribuya 200 microlitros de células a un DE580 de 0,1 en todos los pocillos de una placa de 96 pocillos tratada con cultivo de tejidos de fondo transparente. Después de preparar los agentes de prueba de acuerdo con el protocolo de texto, agregue 2 microlitros del agente de prueba # 1 en las filas A a E, y 2 microlitros del agente de prueba # 2 en las filas E a H, y mezcle bien.
Para replicar los ensayos, incube microplacas de M. smegmatis a 37 grados Celsius, 20% O2 y 5% CO2 durante 1 a 48 horas. En los momentos en los que se utilizará el CARA como lectura, utilice una pipeta multicanal P200 ajustada a 50 a 75 microlitros para volver a suspender cuidadosamente el contenido del pocillo de la placa de ensayo estilo MIC90 pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 5 a 10 veces. A continuación, utilice las puntas de pipeta para agitar suavemente el contenido de los pocillos con movimientos circulares.
Transfiera 10 microlitros del contenido del pocillo de ensayo sin diluir a los pocillos correspondientes de la microplaca CARA, evitando salpicaduras durante las transferencias y asegurándose de que la alícuota de 10 microlitros se detecte en el centro de los pocillos de la microplaca CARA. Con cinta adhesiva, ate pilas de microplacas CARA y luego colóquelas en una bolsa de plástico con cierre. Incube las microplacas de M. smegmatis CARA a 37 grados Celsius con 20% de O2 durante uno o dos días para placas replicantes y durante dos o tres días para placas no replicantes.
Cuando se vea una película de crecimiento bacteriano o colonias macroscópicas más grandes en los pocillos de control negativo, use un solo juego de 12 puntas P200 con una pipeta multicanal para dispensar 40 microlitros de PBS estéril a lo largo del costado de los pocillos y permita que el PBS se distribuya por la parte superior de las microcolonias bacterianas de agar.
Prepare el reactivo revelador CARA mezclando 5 miligramos de resazurina y 50 mililitros de Tween-80 al 5% en PBS. Agregue 50 microlitros de reactivo revelador CARA recién preparado a cada pocillo de la microplaca CARA. Luego, mueva las placas hacia adelante y hacia atrás varias veces para ayudar a distribuir el reactivo a través del agar y la estera bacteriana en cada pocillo. Coloque las placas en una bolsa de plástico con cierre e incube a 37 grados Celsius durante al menos 30 minutos para M. smegmatis.
Antes de leer la fluorescencia, coloque las microplacas CARA en una campana de bioseguridad durante 15 minutos a temperatura ambiente sin las tapas. Cuando utilice espectrofotómetros BSL3 fuera de un gabinete de bioseguridad, adhiera una etiqueta de PCR de calidad óptica sobre la placa y use una toalla de papel suave para sellar herméticamente presionando suavemente sobre la superficie de la etiqueta. Determine la fluorescencia a través de la lectura superior con excitación a 530 nanómetros y emisión a 590 nanómetros.