Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 4:08 min. • July 8th, 2025
Tome tubos que contengan macrófagos reporteros con el gen de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada o la enzima SEAP bajo un promotor inducible.
En un tubo, introduzca un anticuerpo específico para el receptor tipo Toll 2 o TLR2 de macrófagos, neutralizando su actividad.
En otro, agregue un inhibidor para suprimir la señalización de TLR4. Deje el último tubo sin tratar.
Tome un portaobjetos con cámara con una capa adsorbida de patrones moleculares asociados al daño o DAMP, proteínas liberadas durante la necrosis celular.
Agregue macrófagos tratados y no tratados en pocillos separados e incube.
TLR2 y TLR4 en macrófagos no tratados se unen a DAMP, activando los factores de transcripción factor nuclear-kappa-B, o NF-κB, y proteína activadora-1, o AP-1.
Estos se translocan al núcleo y se unen al promotor de SEAP, regulando al alza la producción de SEAP, que se secreta extracelularmente.
Transfiera el sobrenadante que contiene SEAP a una microplaca con un sustrato cromogénico.
SEAP hidroliza el sustrato, produciendo un producto de color púrpura-azul. Mida la absorbancia.
La neutralización de TLR2 reduce fuertemente la producción de SEAP, lo que indica que TLR2 es el mediador princ
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