JoVE Encyclopedia of Experiments
Inmunología
0 vistas • 5:54 min • July 8th, 2025
Tome una placa de pocillos múltiples que contenga fibroblastos de ratón en medios privados de suero. Agregue diluciones seriadas de anticuerpos específicos de TNFα.
Agregue TNFα, una citocina inflamatoria.
incubar. La privación sérica induce estrés celular, lo que hace que las células sean susceptibles a la apoptosis mediada por TNFα.
La unión del TNFα a sus receptores en las células privadas de suero desencadena cascadas de señalización intracelular, activando la cascada de caspasas e induciendo la apoptosis.
Sin embargo, la unión de anticuerpos al TNFα impide su unión al receptor, inhibiendo la activación de las caspasas.
Después de la incubación, agregue una mezcla de reactivos que contenga detergente, un sustrato de caspasa proluminiscente y una enzima luciferasa junto con iones ATP y magnesio. Mezclar e incubar.
El detergente permeabiliza las membranas, liberando caspasas de las células inducidas por TNFα.
El sustrato bioluminiscente contiene un sitio de reconocimiento de caspasas. Caspasas específicas escinden el sustrato, generando aminoluciferina.
La luciferasa oxida su sustrato, la aminoluciferina, lo que da como resultado la emisión de luz.
Mida la intensidad de la luminiscencia para detectar una disminución de la luminiscencia con el aumento de las concentraciones de anticuerpos, lo que indica la potencia de los anticuerpos específicos de TNFα para neutralizar el TNFα y prevenir la apoptosis inducida por TNFα.
Agregue 50 microlitros de suspensión celular a los 60 pocillos internos de la placa de ensayo, comenzando desde la columna 2 hasta la 11. Mezcle la suspensión celular pipeteando para agregar alícuotas a la microplaca. Inmediatamente, transfiera 50 microlitros de las diluciones mapeadas a la placa de ensayo.
Para carriles paralelos, dispense diluciones girando la micropipeta. Las diluciones mapeadas se pueden dispensar en los pocillos en el siguiente orden. Los controles se dispensan en los pozos circundantes.
Diluir TNF-alfa con 500 microlitros de agua ultrapura. Mezclar mediante mezclador de vórtice a 2.200 RPM. Transferir a un tubo de 15 ml y, finalmente, diluir a 40 nanogramos por ml con medio de cultivo de ensayo. Dispense 50 microlitros de la solución de inducción de apoptosis en los 60 pocillos externos internos. Dispense microlitros de la solución de inducción de apoptosis en los 60 pocillos de ensayo internos. Finalmente, incube durante 16 horas.
Al quinto día, reconstituya el sustrato con su solución tampón como se indica en las instrucciones del fabricante. Mezclar invirtiendo cinco veces. Dispense la solución de sustrato y agregue 50 microlitros de la solución de sustrato a cada pocillo de muestra en la placa de ensayo. Además, agregue sustrato a los controles. Agite el ensayo en un mezclador de vórtice a 400 RPM durante tres minutos.
Saque la placa de ensayo del mezclador e incube a temperatura ambiente. Encienda un espectrofotómetro lector de placas. Abra el software Softmax Pro o cualquier programa equivalente. Cargue la microplaca en el espectrofotómetro y ajuste los siguientes parámetros.
Active la función de luminiscencia en el tipo de equipo en la función de punto final. Ajuste el área del equipo excluyendo las columnas 1 y 12. Seleccione el tipo de placa para una microplaca de fondo transparente estándar de 96 pocillos. Modifique el tiempo de integración hasta 1250 milisegundos. Ajuste el tiempo de agitación de la microplaca a 10 segundos. Seleccione la pared en la que se colocará la sustancia de referencia, la sustancia analítica y la muestra de control. Comienza a leer.