Un ensayo in vitro basado en células dendríticas pulsadas por vacuna para inducir la proliferación de linfocitos

Comience agregando los antígenos de la vacuna de prueba al cultivo de células dendríticas.

La célula dendrítica reconoce el antígeno, lo internaliza a través de la endocitosis mediada por receptores, lo fragmenta en péptidos más pequeños y transfiere el complejo antígeno-MHC resultante a la superficie celular para su presentación.

Cocultivar células dendríticas presentadoras de antígeno con linfocitos T vírgenes para permitir la interacción entre el receptor de células T y el complejo antígeno-MHC, junto con sus correceptores.

Esto conduce a la formación de sinapsis inmunológicas, activando los linfocitos T a través de la señalización intracelular.

Los linfocitos T activados experimentan expansión clonal, generando linfocitos T efectores.

Agregue moléculas de citocinas de interleucina-2 o IL-2 al cultivo e incube. La unión de IL-2 desencadena la señalización intracelular, lo que permite la proliferación y supervivencia de los linfocitos.

Tome un pequeño volumen del cultivo y centrifuge. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el sedimento celular con células dendríticas presentadoras de antígeno y transfiéralo al mismo pozo.

La reestimulación con antígeno aumenta la proliferación de linfocitos.

Realice análisis posteriores para cuantificar marcadores específicos asociados con la proliferación de linfocitos.

Para generar MoDC pulsados por antígenos, agregue 1 microlitro por mililitro de vacuna contra el virus de la rabia o suspensión de RV a 1 mililitro de cultivo de MoDC ingenuo en la placa de 24 pocillos e incube la placa durante 48 horas al 5% de dióxido de carbono y 37 grados Celsius. El séptimo día, mantenga la placa de 24 pocillos que contiene los MoDC pulsados por antígenos en hielo durante 10 minutos antes de agregar 1 mililitro de PBS helado por pocillo y mezclarlo bien. Transfiera la suspensión a un tubo de 15 mililitros.

Lave los pocillos con 2 mililitros de PBS helado. Recoja las células residuales dentro de cada pocillo y transfiera el contenido lavado a sus respectivos tubos. Centrifugar la suspensión celular a 500 g durante 7 minutos. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el sedimento celular de MoDC pulsado por antígeno en un medio de cultivo completo para ajustar la concentración final de 100.000 células por mililitro.

Para el cocultivo de linfocitos MoDC, siembre los pocillos de una placa estéril de 24 pocillos con 1 mililitro de la suspensión de células linfocitarias vírgenes y 1 mililitro de suspensión de MoDC pulsada por antígeno o no pulsada por antígeno en el séptimo día del pulso de antígeno. Después de dos días de incubación, complemente cada pocillo con 20 nanogramos por mililitro de interleucina-2 recombinante y continúe la incubación durante otras 120 horas.

El día 14, transfiera 1 mililitro del cocultivo a un tubo estéril de 1,5 mililitros y centrifugue el tubo. Luego, vuelva a suspender el gránulo celular con 1 mililitro de MoDC pulsados o no pulsados por antígeno. Mezclar bien y transferir las suspensiones celulares a sus pocillos correspondientes.

Después de la tinción de la superficie celular de los PBMC y los linfocitos y monocitos vírgenes, transfiera 1 mililitro de la suspensión celular a un tubo estéril de 1,5 mililitros con una pipeta y centrifugue durante 10 minutos a 500 g. Luego, vuelva a suspender el gránulo en 1 mililitro de PBS y transfiéralo a un tubo de 15 mililitros. Además, recolecte las células residuales y los tubos correspondientes usando 1 mililitro de PBS. Luego, agregue 10 mililitros de PBS al tubo de 15 mililitros que contiene las células y mezcle pipeteando.

Después de centrifugar el tubo durante 7 minutos a 850 g, retire el sobrenadante y vuelva a suspender con cuidado el sedimento celular con la suspensión residual que queda después de decantar el sobrenadante. Transfiera la suspensión celular a una placa de 96 pocillos con fondo en V y selle los pocillos para evitar derrames.

Una vez completada la tinción, realice el análisis del citómetro de flujo. Desde la vista previa en tiempo real, ajuste el umbral de fluorescencia, incluido el voltaje, la ganancia y el tamaño de la celda para eventualmente dibujar puertas alrededor de la población celular deseada y excluir cualquier residuo celular.