Una técnica de tinción de tetrámero de péptido-MHC-I para analizar células T de memoria CD8⁺ específicas de SIV

Tome células mononucleares de sangre periférica de primates no humanos, o PBMC, que contengan células T de memoria CD8⁺ contra el virus de la inmunodeficiencia simia o SIV.

Agregue un inhibidor de la proteína quinasa para evitar la internalización del receptor de células T o TCR tras la estimulación posterior.

Introducir complejos de histocompatibilidad peptídica-mayor de clase I, o tetrámeros pMHC-I, complejos conjugados con fluoróforos que comprenden cuatro moléculas MHC-I unidas a péptidos específicos de SIV. Estos péptidos se unen a los TCR en la superficie de las células T.

Agregue una mezcla que contenga anticuerpos conjugados con fluoróforos que se unan a CD8, CD28 y CCR7, marcadores que delinean subconjuntos de células T de memoria, y anticuerpos que marcan células no CD8⁺.

Un tinte de viabilidad fluorescente marca las células muertas.

Arregla las celdas. Permeabilizarlos para acceder a dianas intracelulares.

Agregue anticuerpos conjugados con fluoróforos que se unen a CD3, un marcador de células T, y granzima B intracelular, un marcador de células T CD8⁺ activadas.

Usando citometría de flujo, excluya las células T no CD8⁺ y las células muertas.

Gate pMHC-I tetrámero positi