Imágenes de resonancia de plasmón de superficie localizada para detectar secreciones de proteínas de una sola célula

Comience con un chip sensor de vidrio con matrices nanoestructuradas de oro funcionalizadas con una monocapa autoensamblada que contiene grupos carboxilo.

Asegure el chip dentro de un conjunto microfluídico e introduzca un enlazador, para activar los grupos carboxilo.

Agregue ligandos peptídicos, conjugándolos con los grupos carboxilo activados a través de enlazadores.

Tratar con un tampón que contenga compuestos desactivadores, desactivando los sitios de unión no específicos, y lavar con un tampón.

Enfoca una luz polarizada en el chip. Usando un sistema de imágenes de resonancia de plasmón de superficie localizada, obtenga una imagen de las matrices, que aparecen como cuadrados brillantes sobre un fondo oscuro.

En el ángulo de resonancia, los electrones de oro absorben la luz. Mida la intensidad de la luz reflejada en el ángulo correspondiente para generar la respuesta del sensor.

Introducir células de hibridoma secretoras de proteínas, que se unen al chip y se lavan.

Las células unidas secretan proteínas que interactúan con los ligandos en la matriz cercana.

Estas interacciones alteran el ángulo y la intensidad de la luz reflejada, lo que resulta en un cambio en la respuesta del sensor, confirmando la actividad secretora de las células.

Para limpiar y regenerar la resonancia de plasmón de superficie localizada, o chips LSPR, ceniza de plasma a una potencia de 40 vatios en una mezcla de 300 mililitros de 5% de hidrógeno y 95% de argón durante 45 segundos. Funcionalice la superficie de oro y las nanoestructuras inmediatamente después de la incineración del plasma sumergiendo el chip en una solución de tiol etanólico de dos componentes que consiste en una proporción de 3 a 1 de SPO y SPC. Después de dejar el chip en la solución de tiol durante la noche para formar una monocapa autoensamblada, enjuáguelo con etanol y séquelo con gas nitrógeno.

Cargue el chip LSPR dentro de un soporte microfluídico hecho a medida colocando el chip en una pieza inferior de aluminio. Luego, coloque el chip entre esta pieza inferior y una junta de silicona y una pieza superior de plástico transparente usando cuatro tornillos para sujetar el ensamblaje.

Para una aplicación típica de tiol a base de SPC, aplique una capa protectora de 300 microlitros de una mezcla 1 a 1 de EDC 133 milimolares y NHS de 33 milimolares en agua destilada desionizada para activar los grupos carboxilo del componente tiol SPC. Después de esperar 10 minutos, enjuague manualmente la superficie con PBS de 10 milimolares.

Después de esto, conjuga el grupo carboxilo activado con el ligando de interés mediante un recubrimiento de gotas de 300 microlitros de la solución del ligando. Después de esperar 1 hora y enjuagar la superficie con PBS 10 milimolares, aplique una capa protectora de 300 microlitros de etanolamina 0,1 molar en PBS en el chip para minimizar la unión inespecífica. Después de esperar 10 minutos, lave la etanolamina con PBS, que contiene 0.005% Tween 20 o PBS-T20.

A continuación, coloque una pieza de cuarzo sobre el chip para reducir las fluctuaciones en los datos relacionados con un menisco cambiante. Mantenga el chip húmedo con el tampón PBS-T20 mientras se monta en el microscopio. Conecte el tubo de microfluidos al conjunto y al amortiguador de flujo hasta que se alcance un estado estable. Luego, coloque el conjunto de puntas LSPR firmemente en el soporte de muestra de la platina calentada.

La configuración óptica para este método se muestra aquí. La luz de la lámpara halógena pasa a través de un filtro de paso de 593 nanómetros de largo para eliminar las longitudes de onda, que no contribuyen a la respuesta nanoplasmónica. Luego, la luz se polariza linealmente y la muestra se ilumina a través de un objetivo de apertura numérica de 40x 1.4 para la excitación de las nanoestructuras plasmónicas de oro. La luz dispersa es recogida por el objetivo y pasa a través de un polarizador cruzado para reducir la señal de fondo del sustrato de vidrio. Se inserta un divisor de haz 50/50 en la trayectoria de luz recolectada para análisis espectroscópico e imágenes simultáneos.

Después de permitir que el ensamblaje y el microscopio se equilibren durante al menos dos horas, alinee el chip con el joystick para que la matriz central esté alineada con la fibra óptica para espectroscopia. Después de cultivar y peletizar células de hibridoma por centrifugación, coseche ellas. Luego, pruebe la viabilidad antes de introducirlos en los chips LSPR. A continuación, introduzca 50 microlitros de la solución celular manualmente en los chips LSPR con una micropipeta. Finalmente, lave las células restantes en solución con medios frescos sin suero utilizando un sistema de perfusión microfluídica para preparar los chips LSPR para la obtención de imágenes.