Cuantificación de la actividad de secuestro autofágico a granel en células de mamíferos

La autofagia a granel implica el secuestro de carga autofágica y proteínas citosólicas solubles, incluida la lactato deshidrogenasa o LDH, dentro de los autofagosomas para su degradación.

Para evaluar el secuestro de LDH, que refleja la actividad autofágica a granel, tome una cubeta de electroporación con células hambrientas de nutrientes tratadas con inhibidores para bloquear la degradación autofágico-lisosomal.

Realice electroporación para interrumpir selectivamente la membrana celular y liberar proteínas solubles.

Mezcle el disruptor celular con una solución de sacarosa tamponada para preservar los componentes celulares.

Transfiera la solución disruptiva diluida requerida a un tubo que contenga tampón. Centrifugar para separar la LDH no secuestrada de la LDH secuestrada por autofagosomas.

Transfiera la solución disruptiva diluida restante, que contiene la fracción de LDH celular total, a otro tubo.

Agregue un tampón que contenga tensioactivo no iónico a ambos tubos para extraer las fracciones de LDH secuestradas y totales.

Centrifugar y transferir sobrenadantes que contienen LDH a tubos que contienen tampón con piruvato y NADH.

La LDH convierte el piruvato en lactato con la oxidación de NADH, disminuyendo los niveles de NADH que se correlacionan con la concentración de LDH.

Cuantificar la LDH en fracciones celulares sedimentadas y totales para determinar el secuestro de LDH.

Con una pipeta, vuelva a suspender el gránulo celular para obtener una suspensión casi unicelular. Transfiera esta suspensión a una cubeta de electroporación de 4 milímetros. Coloque la cubeta en un electroporador de ondas de decaimiento exponencial y descargue un solo pulso eléctrico a 800 voltios, 25 microfaradios y 400 ohmios.

Utilice una nueva punta de pipeta para transferir la célula que la altera a un tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetros que contenga 400 microlitros de solución de sacarosa tamponada con fosfato helada y mezcle brevemente mediante pipeteo. Repita este proceso de resuspensión, interrupción de electrodos y mezcla para cada muestra. Si realiza el procedimiento por primera vez, asegúrese de verificar la interrupción eficiente y selectiva del electrodo de la membrana plasmática como se describe en el texto.

Para obtener fracciones de LDH sedimentadas, elimine 550 microlitros de cada solución diluida con disrupción celular y transfiérala a su propio tubo de microcentrífuga de 2 mililitros que contiene 900 microlitros de tampón de resuspensión helada con 0,5% de BSA y 0,01% de Tween-20. Pipetear brevemente para mezclar. Centrifugar a 18.000 veces g y 4 grados centígrados durante 45 minutos para producir pellets que contengan LDH sedimentada. Usando succión, aspire bien el sobrenadante para dejar los gránulos lo más secos posible.

Almacene las muestras de LDH sedimentadas a menos 80 grados Celsius hasta que estén listas para analizar. Para las fracciones totales de LDH, transfiera 150 microlitros de cada una de las soluciones diluidas con disrupción celular a su propio tubo nuevo. Guárdelos en un congelador a menos 80 grados centígrados hasta que estén listos para analizar.

Descongele tanto la LDH sedimentada como las muestras totales de LDH en hielo. Una vez descongelado, agregue 300 microlitros de tampón de resuspensión helado que contenga 1.5% de Triton X-405 al total de muestras de LDH. Gire las muestras sobre un rodillo en una cámara frigorífica durante 30 minutos. A continuación, agregue 750 microlitros de tampón de resuspensión helada que contenga Triton X-405 al 1% a las muestras sedimentadas de LDH. Utilice una pipeta para volver a suspender los gránulos hasta que la solución sea homogénea. Centrifugar todas las muestras a 18.000 veces g en 4 grados Celsius durante cinco minutos para sedimentar los desechos celulares no disueltos.

Una vez completada la centrifugación, coloque las muestras en hielo. Determine los niveles de LDH en los sobrenadantes utilizando un ensayo enzimático clásico como se describe en el texto o cualquiera de la amplia variedad de kits disponibles comercialmente.