Cuantificación de la actividad de secuestro autofágico a granel en células de mamíferos
Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 4:33 min. • July 8th, 2025
La autofagia a granel implica el secuestro de carga autofágica y proteínas citosólicas solubles, incluida la lactato deshidrogenasa o LDH, dentro de los autofagosomas para su degradación.
Para evaluar el secuestro de LDH, que refleja la actividad autofágica a granel, tome una cubeta de electroporación con células hambrientas de nutrientes tratadas con inhibidores para bloquear la degradación autofágico-lisosomal.
Realice electroporación para interrumpir selectivamente la membrana celular y liberar proteínas solubles.
Mezcle el disruptor celular con una solución de sacarosa tamponada para preservar los componentes celulares.
Transfiera la solución disruptiva diluida requerida a un tubo que contenga tampón. Centrifugar para separar la LDH no secuestrada de la LDH secuestrada por autofagosomas.
Transfiera la solución disruptiva diluida restante, que contiene la fracción de LDH celular total, a otro tubo.
Agregue un tampón que contenga tensioactivo no iónico a ambos tubos para extraer las fracciones de LDH secuestradas y totales.
Centrifugar y transferir sobrenadantes que contienen LDH a tubos que contienen tampón con piruvato y NADH.
La LDH convierte el piruvato en lactato con la oxid
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