Un ensayo para evaluar la eficacia de un fármaco frente a un modelo de infección por Mycobacterium tuberculosis

Tome una placa multipocillo que contenga un modelo establecido de infección por Mycobacterium tuberculosis o Mtb.

Los pocillos contienen agregados celulares que comprenden un núcleo de macrófagos necróticos infectados con Mtb y Mtb densamente empaquetados, rodeados de macrófagos no infectados, que imitan la infección in vivo.

Tome una dilución seriada de los antibióticos rifampicina y moxifloxacina.

Deseche los medios de la placa de infección, transfiera las diluciones de antibióticos a los pocillos e incube.

Los antibióticos se difunden a través de los agregados celulares y entran en las células bacterianas.

La rifampicina se une a la ARN polimerasa bacteriana, inhibiendo la síntesis de ARN y causando la muerte bacteriana.

La moxifloxacina se une a la topoisomerasa del ADN bacteriano, inhibiendo la replicación y deteniendo el crecimiento bacteriano. La unión también induce respuestas de estrés, incluida la acumulación de especies reactivas de oxígeno, matando a las bacterias.

Después de la incubación, agregue resazurina, un indicador redox. Dentro de las bacterias vivas y metabólicamente activas, la enzima oxidorreductasa reduce la resazurina azul a resorufina fluorescente rosa.

Mida la fluorescencia para detectar bacterias viables.

La supervivencia bacteriana disminuye con el aumento de la concentración de antibióticos, mostrando su eficacia contra Mtb.

Para las pruebas de drogas, prepare dos medicamentos antituberculosos por triplicado en una nueva placa de 96 pocillos de la siguiente manera. Primero, agregue 125 microlitros de medio 7H9-C a los pocillos B2 a G10. A continuación, prepare los dos medicamentos al doble de la concentración final más alta deseada en 1 mililitro de 7H9-C.

Con una pipeta, agregue 250 microlitros de cada fármaco a los pocillos B, C y D-11, y luego E, F y G-11 respectivamente para tratamientos por triplicado. A continuación, utilizando una pipeta multicanal, diluya en serie los fármacos de prueba dos veces moviendo 125 microlitros de B11 a G11 a B10 a G10. Mezclar pipeteando cinco veces en cada paso.

Continúe moviendo 125 microlitros de columna en columna, de derecha a izquierda a través de la placa, y deténgase después de la columna 4. Después de mezclar la columna 4, deseche 125 microlitros en un contenedor de residuos. Las columnas 2 y 3 no deben contener ningún medicamento. Esto permitirá que se utilicen como fondo y para controles de crecimiento positivos.

A continuación, recupere la placa de 96 pocillos que contiene los macrófagos infectados con Mtb de la incubadora. Sin inclinar la placa, utilice una pipeta multicanal para extraer 150 microlitros de medio de los pocillos B2 a G11. Luego, incline la placa como se muestra aquí, inserte las puntas de la pipeta en el borde inferior de los pocillos y retire el medio restante, aproximadamente 50 microlitros.

Como los agregados de macrófagos de Mtb se adhieren al fondo del pozo, no se debe perder material. Sin embargo, la extracción del medio debe ser lo más suave posible y se debe tener cuidado para evitar la resuspensión durante este proceso.

Suavemente, agregue 100 microlitros de medio 7H9-C a los pocillos B2 a G11 de la placa, que contienen los agregados de macrófagos Mtb. Con una pipeta multicanal, transfiera 100 microlitros de la placa de 96 pocillos que contiene el fármaco a los pocillos correspondientes de la placa de infección. Luego, coloque el plato en una bolsa sellada e incube durante tres días a 37 grados centígrados.

El ensayo de resazurina se basa en las especies oxidativas producidas por Mtb metabólicamente activo para convertir la resazurina azul en resorufina rosa fluorescente. El cambio de color y fluorescencia se puede utilizar como marcador sustituto para determinar la cantidad de crecimiento bacteriano.

Prepare una solución madre de resazurina a una concentración final de 0,8 miligramos por mililitro en agua. Filtre a través de una membrana de PVDF de tamaño de poro de 0,22 micrómetros para esterilizar. Prepare una solución de trabajo en resazurina mezclando la solución madre, el agua y Tween-80 en una proporción de 2 a 1 a 1. Las concentraciones finales son de 0,4 miligramos por mililitro de resazurina en 5% Tween-80.

Usando un lector de placas, configure un programa para leer la fluorescencia a una excitación de 530 nanómetros y una emisión de 590 nanómetros durante 24 horas cada 30 minutos a 37 grados Celsius. Precaliente el lector de placas a 37 grados centígrados.

Con una pipeta multicanal, agregue 20 microlitros de solución de trabajo de resazurina a los pocillos B2 a G11 de la placa tratada con fármaco. Coloque la placa en el lector e inicie el programa.