Enciclopedia de Experimentos de JoVE
Inmunología
0 visualizaciones • 3:53 min. • July 8th, 2025
Tome una placa de pocillos múltiples con diferentes macrófagos reporteros que albergan el gen de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada, o SEAP, o un gen de luciferasa secretado bajo promotores inducibles.
Agregue medios que contengan diferentes híbridos de péptidos y nanopartículas de oro mezclados con lipopolisacáridos o LPS a los pocillos designados.
El LPS se une a los receptores tipo toll de los macrófagos, o TLR, desencadenando la internalización en el endosoma.
La bomba de protones endosomal transporta protones en su interior. La acidificación desencadena la señalización de TLR, activando factores de transcripción.
Estos factores inducen la expresión de los genes reporteros, produciendo SEAP o luciferasa.
Alternativamente, la internalización de LPS junto con los híbridos hace que los grupos peptídicos cargados negativamente secuestren protones luminales, evitando la acidificación endosomal e inhibiendo la señalización de TLR.
Recoja el medio, centrifugue para separar el sobrenadante y agregue sustratos para SEAP y luciferasa.
SEAP convierte su sustrato en un producto coloreado, mientras que la luciferasa cataliza su sustrato para producir luminiscencia.
Una reducción en las señales indicadoras indica la efectividad de los híbridos en la inhibición de la señalización de TLR.
Centrifugar 20 volúmenes de la solución híbrida péptido-GNP en tubos eppendorf de 1,5 mililitros a 18.000 veces g durante 30 minutos. Deseche con cuidado los sobrenadantes. Transfiera los híbridos a un solo tubo nuevo y lávelos dos veces con 1 mililitro de PBS. Después de esto, vuelva a suspender los híbridos lavados en un volumen de medio R10. Mezcle volúmenes iguales de los híbridos concentrados y el medio R10 que contiene LPS de modo que la concentración final de los híbridos y LPS sea de 100 nanomolares y 10 nanogramos por mililitro respectivamente.
A continuación, retire el medio de cultivo de la placa de cultivo de macrófagos. Agregue 100 microlitros de la mezcla híbrida-LPS en cada pocillo con tres réplicas para cada condición. Incluya un control negativo y un control LPS. Incube a 37 grados centígrados durante 24 horas, luego transfiera el medio de cada pocillo a un tubo de centrífuga separado. Centrifugar los tubos a 18.000 veces g en 4 grados centígrados durante 30 minutos. Transfiera los sobrenadantes a una placa inferior redonda nueva de 96 pocillos.
Para comenzar el ensayo reportero en estas muestras, agregue 180 microlitros de solución QUANTI-Blue precalentada a cada pocillo de una nueva placa de fondo plano de 96 pocillos, luego transfiera 20 microlitros de los sobrenadantes de cada muestra a esta placa. Incube a 37 grados Celsius durante una o dos horas hasta que el color azul oscuro se desarrolle a una densidad óptica superior a 1. Después de esto, use un lector de placas para registrar la absorción a 655 nanómetros. A continuación, transfiera 10 microlitros de sobrenadante fresco de cada muestra a una placa blanca transparente de fondo plano de 96 pocillos.
Usando un inyector automático, agregue 50 microlitros de la solución de luciferasa a cada pocillo e inmediatamente registre la luminiscencia pozo por pocillo. Luego, valide el efecto inhibidor de los posibles candidatos y evalúe la especificidad de TLR como se describe en el protocolo de texto.