Ensayo de formación de focos para cuantificar los títulos de virus en los órganos de un ratón infectado

Tome una placa de pocillos múltiples que contenga una monocapa de células de mamíferos.

Inocular los pocillos con diluciones seriadas de homogeneizados de tejido que contienen el virus del Zika, derivado de diferentes órganos de un ratón infectado.

Al ingresar a las células a través de la endocitosis, el virus se multiplica y brota para infectar las células vecinas.

Recubrimiento con una solución de metilcelulosa de alta viscosidad, creando una barrera física que restringe el movimiento del virus.

La barrera solo permite la infección de células vecinas inmediatas, formando focos de células infectadas, y garantiza que cada foco se origine en una sola partícula de virus, lo que permite una cuantificación precisa.

Fije las células y permeabilice la membrana. Agregue anticuerpos primarios que ingresan a las células e interactúan con el antígeno viral.

Introducir un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa que se une al anticuerpo primario.

Agregue un sustrato cromogénico que se convierta en peroxidasa para crear manchas de color, lo que indica los focos de las células infectadas.

Cuente los focos para cuantificar el título del virus en los diferentes órganos del ratón.

Retire las muestras homogeneizadas del congelador a menos 80 grados centígrados y déjelas descongelar. Con las muestras en hielo, diluya el virus del Zika 10 veces en el primer pocillo de la placa de dilución y use una pipeta multicanal para hacer diluciones en serie de 10 veces en la placa, cambiando las puntas cada vez agregando 20 microlitros de muestra en 180 microlitros de medios de cultivo.

Cambie las puntas de la pipeta entre cada dilución. Prepare la placa formadora de foco retirando el medio de la placa de 96 pocillos de fondo plano preparada que cubre las células Vero. Para evitar que la monocapa se seque, agregue inmediatamente 100 microlitros de la dilución del virus a cada pocillo en la placa Vero. Use el mismo conjunto de consejos para agregar de la concentración más baja a la más alta.

Balancee las placas de lado a lado de 2 a 4 veces e incube a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante una o dos horas. Caliente la metilcelulosa al 2% a temperatura ambiente. Luego, diluya la solución de metilcelulosa al 2% en medios de cultivo en una proporción de aproximadamente 2 a 1. Después de la incubación, agregue 125 microlitros del medio de crecimiento de metilcelulosa a cada pocillo de las placas de 96 pocillos. Incubar nuevamente a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 32 a 40 horas.

Para fijar las células Vero, en un gabinete de bioseguridad, agregue 50 microlitros de paraformaldehído al 5% sobre la parte superior de la capa de metilcelulosa en cada pocillo de las placas de 96 pocillos. Incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Alternativamente, cubra los platos con parafilm y colóquelos a 4 grados centígrados durante la noche.

Después de eso, use una pipeta para eliminar la capa y los medios de las células en un recipiente desechable dentro del gabinete de bioseguridad. Lavar suavemente con 150 microlitros de PBS por pocillo. Retire el PBS de las placas y retire la placa del gabinete de bioseguridad. Repita el lavado de PBS dos veces. Luego, agregue 150 microlitros por pocillo una vez tampón de lavado FFA y déjelo a temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos para permeabilizar las células fijas.

Luego, use el anticuerpo primario contra el Zika para detectar la infección. Prepare el anticuerpo primario 4G2 a una concentración de 1 microgramo por mililitro en tampón de tinción FFA. Retire el tampón de lavado FFA de las placas y agregue 50 microlitros del anticuerpo primario en el tampón de tinción FFA a cada pocillo. Luego, selle las placas con parafilm o película plástica e incube durante la noche a 4 grados centígrados.

Prepare el anticuerpo secundario marcado con HRP anti-ratón de cabra a una concentración de 1 a 5,000 en tampón de tinción FFA. Después de retirar la solución de anticuerpos, lave las células tres veces con 150 microlitros de tampón de lavado FFA por pocillo. Retire el tampón de lavado metiéndolo en el fregadero cada vez.

Tiña las células con el anticuerpo secundario en tampón de tinción FFA a 50 microlitros por pocillo e incuba una o dos horas a temperatura ambiente. Después de eso, lave las celdas tres veces con el tampón de lavado FFA nuevamente, eliminando el tampón de lavado golpeando el fregadero cada vez.

Agregue 50 microlitros del sustrato Trueblue en cada pocillo. Espere de 2 a 15 minutos hasta que los puntos estén completamente definidos con un fondo mínimo. Después de que las manchas sean visibles, lávese suavemente con agua usando una mano para proteger la monocapa de la fuerza del agua que corre. Seque con grifo sobre toallas de papel.

Poco después, use un endoscopio de disección para contar manualmente los puntos en cada pocillo o use un contador de puntos automatizado. En el software de inmunocaptura, seleccione una dilución con focos fácilmente distinguibles entre 20 y 200 por pocillo para cada muestra, y calcule el título en unidades formadoras de foco por mililitro utilizando el promedio de pocillos duplicados.